Detecção de Leishmania chagasi em Lutzomyia longipalpis por meio de qPCR em tempo real: triagem de genes e métodos quantitativos
Autor(es):
Vasconcelos, Diana Romão Bezerra
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2010
Resumo:
A Leishmaniose Visceral é uma doença endêmica no Brasil cujo agente etiológico é o
protozoário Leishmania chagasi e o principal vetor é o flebotomíneos da espécie Lutzomyia
longipalpis. Estudos epidemiológicos têm utilizado a PCR convencional para mensurar a taxa de
infecção de flebotomíneos coletados a campo. Entretanto, a PCR em tempo real consegue
detectar cargas parasitária muito baixas, reduzindo a quantidade de falso negativo e
quantificando o número de leishmânias no flebotomíneos. Este trabalho objetivou comparar
genes com diferentes números de cópias para detectar e quantificar L. chagasi em diferentes
pools de L longipalpis através da PCR em tempo real. Foram misturados pools de L longipalpis
contendo 1, 10 e 30 exemplares machos com L. chagasi oriunda de dilução seriada, formando
grupos com 50, 500, 5.000 e 50.000 parasitos. Para amplificação do DNA de L. chagasi, foram
usados primers direcionados para o gene que codifica a polimerase α, a subunidade ribossomal
18S e o kDNA. A especificidade foi determinada pela análise da curva de melting após cada
PCR e visualização do produto amplificado em gel de agasose a 1,5%. Os parasitos foram
mensurados por quantificação absoluta e relativa. Determinou-se a lineridade (R2
) e a eficiência
(E) das reações de PCR a partir de curvas padrão geradas para cada gene usando diluições
seriadas de DNA de leishmânia e flebotomíneo. As curvas padrão foram estabelecidas com
amostras variando de 0,23 fg a 2,3 ng de DNA de leishmâmia e 1,46 pg a 14,6 ng de DNA de
flebotomíneo. A análise da PCR demonstrou a capacidade de amplificar até 0,004 parasitas. A
quantificação dos parasitos usando primers que amplificam o gene da polimerase α apresentou
inexatidão, principalmente em grupos com reduzido número de leishmânias. Em relação ao gene
que codifica o 18S, a estimativa foi mais exata, porém imprecisa. Os melhores resultados foram
observados com os primers que amplificam o kDNA, especialmente na quantificação relativa,
onde não houve interferência do tamanho do pool de flebotomíneos. A amplificação do kDNA
apresentou a maior sensibilidade dentre os genes testados, bem como mensurações exatas e
precisas.
Palavras-Chave: Leishmania chagasi, Lutzomyia longipalpis, PCR, genes.
Abstract:
Visceral leishmaniasis is an endemic disease in Brazil. Its etiological agent is Leishmania
chagasi, and its main vector species is the sand fly Lutzomyia longipalpis. Epidemiological
studies have used conventional PCR to measure the rate of infection of sand flies collected in the
field. However, real-time PCR can detect lower parasitic loads, reducing the number of false
negatives and improving the quantification of Leishmania in the sand fly. This paper aimed to
compare genes with various numbers of copies to detect and quantify L. chagasi in various pools
of L. longipalpis by real-time PCR. We mixed pools of 1, 10 and 30 male sand flies with L.
chagasi from serial dilution, forming groups with 50, 500, 5000 and 50000 Leishmania parasites.
For the amplification of L. chagasi DNA, primers targeting kDNA and the genes encoding the
polymerase and the 18S subunit of the ribosome were employed. Specificity was determined
by melting-curve analysis after each PCR and by visualization of amplicons on 1.5% agarose
gels. Parasites were measured by absolute and relative quantification. To determine the linearity
(R2
) and the efficiency (E) of the PCR amplifications, standard curves were generated for each
gene using serial dilutions of Leishmania and sand fly DNA. The standard curves were
established with samples ranging from 0.23 fg to 2.3 ng of Leishmania DNA and 1.46 pg to 14.6
ng sand fly DNA. The PCR analysis demonstrated the capacity to amplify the DNA equivalent
of 0.004 parasites. Parasite quantification using primers targeting the polymerase gene
exhibited inaccuracy, especially in groups with reduced numbers of Leishmania protozoans, and
the measurements suffered interference from the number of sand flies present in the sample.
Conversely, in the case of primers targeting the gene encoding the 18S ribosomal subunit, the
estimates were more accurate, but imprecise. The best results were observed with primers
targeting kDNA, especially in the relative quantification, which indicated no interference from
the pool of sand flies and demonstrated the greatest sensitivity among the genes tested as well as
accurate and precise estimates.
Keywords: Leishmania chagasi, Lutzomyia longipalpis, PCR, genes.
Tipo do Trabalho:
Dissertação
Referência:
Vasconcelos, Diana Romão Bezerra. Detecção de Leishmania chagasi em Lutzomyia longipalpis por meio de qPCR em tempo real: triagem de genes e métodos quantitativos. 2010. 68 f. Dissertação (Mestrado Acadêmico ou Profissional em 2010) - Universidade Estadual do Ceará, , 2010. Disponível em: Acesso em: 29 de abril de 2024
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