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Visualização do Trabalho Acadêmico
Repositório Institucional - UECE
Título:
Avaliação molecular da biossíntese de ácido ascórbico e possível participação da Oxidase alternativa em dois clones de aceroleira (Malpighia emarginata DC).

Autor(es):
SARAIVA, LUIS FLÁVIO MENDES

Palavras Chaves:
Não informado

Ano de Publicação:
2011

Resumo:
A acerola Malpiguia emarginata DC é uma fruta dotada de qualidades nutricionais
invejáveis, sendo consumida tanto in natura quanto processada. A principal
característica que destaca a acerola é sua enorme capacidade em sintetizar o ácido
ascórbico. A Embrapa desenvolveu quatro clones comerciais com características
fenotípicas e genéticas bem definidas denominado BRS 235 (Apodi), BRS 236 (Cereja),
BRS 237 (Roxinha) e BRS 238 (Frutacor). Os clones BRS 236 (Cereja) e BRS 237
(Roxinha) foram escolhidos devido a enorme diferença de ácido ascórbico sintetizada
entre eles, aproximadamente 50% a mais no clone Cereja. Para esse estudo foi analisada
a expressão gênica das enzimas pertencentes a via Wheeler/Smirnoff, reconhecida como
a principal via biossintética do ácido ascórbico em plantas bem como a Oxidase
alternativa (AOX) uma enzima desacopladora, não fosforilante e insensível ao cianeto,
presente entre os complexos II e III da membrana mitocondrial interna, responsável pela
via alternativa de elétrons. O objetivo desse trabalho foi identificar quais enzimas são
determinantes na diferença do conteúdo de vitamina C entre os clones, bem como
avaliar a expressão da AOX nos diferentes tecidos. De aceroleiras com cinco anos de
idade foram colhidos quatro tecidos (Flores, Frutos verdes, Frutos semimaduros e
Frutos maduros. Inicialmente os teores de ácido ascórbico foram dosados nos frutos
verdes, semimaduros e maduros dos dois clones por titulometria de Tillman. Em
seguida foi realizada a caracterização gênica da AOX para definição de suas isoformas.
Após o isolamento do DNA e executadas as reações de PCR com um par de primers
degenerados os amplicons foram purificados e submetidos a clonagem, transformação e
seqüenciamento. As dosagens de ácido ascórbico mostraram que ambos os clones
decrescem seus níveis de ácido ascórbico a medida que os frutos se desenvolvem, além
do que em todos os três estádios de desenvolvimento o clone Cereja apresenta
quantidades de ácido ascórbico superiores ao clone Roxinha. Os níveis de ácido
ascórbico entre os frutos verdes e maduros de ambos os clones revelaram que o clone
Roxinha possui uma menor diferença entre esses dois estádios de desenvolvimento. As
análises de expressão gênica revelaram que três enzimas possuem sua expressão
destacada das demais, sendo que essas mostraram um sinergismo de expressão com o
padrão decrescente dos níveis de vitamina C contida no tecido, apresentando ainda
diferenças de expressão favoráveis ao clone Cereja. São elas: Manose pirofosforilase,
GDP-Manose 3’5’ epimerase e GDP Galactose fosforilase. Com maior destaque para a
GDP-Manose 3’5’ epimerase e GDP Galactose fosforilase. Não existiam diferenças nas
expressões gênicas das demais enzimas da via Wheeler/Smirnoff que justificassem as
diferenças nos teores de ácido ascórbico presentes nos tecidos e também entre os clones.
Quanto a AOX os resultados revelaram duas seqüências, uma relativa a uma AOX1 e
outra a uma AOX2. A análise da expressão gênica das isoformas da AOX demonstrou
que a AOX1 eleva sua expressão gênica em ambos os clones a medida que os frutos
amadurecem entretanto, o clone Roxinha possui uma expressão gênica mais elevada que
o clone Cereja, em todos os três estádios de desenvolvimento. A AOX2 possui
diferenças de expressão gênica onde no clone Cereja ela se mostrou decrescente, já no
clone Roxinha ocorreu a elevação da expressão nos três estádios de desenvolvimento.
Três enzimas são essenciais a biossíntese do ácido ascórbico em Malpiguia emarginata
DC, a Manose pirofosforilase, GDP-Manose 3’5’ epimerase e GDP Galactose
fosforilase, sendo a via Wheeler/Smirnoff determinante na quantidade de ácido
ascórbico produzido. As expressões gênicas da AOX1 e AOX2 favorecem o clone
Roxinha, aparentemente como um mecanismo compensatório por esse clone sintetizar
menos ácido ascórbico que o clone Cereja.  

 




Abstract:
The acerola, Malpiguia emarginata DC is a fruit small endowed with enviable
nutritional qualities, being consumed both fresh and processed. The mail feature that
stands out from other species is its enormous capacity to synthesize ascorbic acid. In
this sense, Embrapa has developed four commercial clones with phenotypic and genetic
characteristics well defined. The clones BRS 235 (Apodi), BRS 236 (Cereja), BRS 237
(Roxinha) e BRS 238 (Frutacor) have characteristics fully standardized. This study
aimed to evaluate the clones BRS 236 (Cereja) and BRS 237 (Roxinha) were selected
because of huge amount of ascorbic acid synthesized between then, approximately 50%
in Cereja clone. For this study we analyzed the gene expression of enzymes of the way
Wheeler /Smirnoff as well as the Alternative Oxidase (AOX). The last step this of this
pathway ends in the inner mitochondrial membrane, due to the presence of
transmembrane enzyme L-Galactono-1,4- Lactone dehydrogenase (L-GalLdh), located
between the complex III and IV. Since the alternative oxidase is an enzyme
uncoupling, no phosphorylating and insensitive to cyanide, among the complexes II and
III of the inner mitochondrial membrane, responsible for alternative pathway of
electrons. This study aimed to identify the enzymes that are crucial in this process and
generate the difference between the clones, as well as the probable relationship between
the biosynthesis of ascorbic acid and the role that the AOX could play. Acerola five
years of age were harvested four tissues (flowers, unripe, semi mature and mature
fruits). The first step of this work was the determination of ascorbic acid in unripe, semi
mature and mature fruits of the two clones by titration of Tillman. Then, we performed
the characterization of the AOX gene to define its isoforms. After isolation of DNA and
carried out the reactions of PCR with degenerate primers the amplicons were purified
and subjected to cloning, transformation and sequencing. The results revealed sequences
that correspond to one AOX1 and one AOX2. The next step of work was the study of
gene expression of enzymes to the Wheeler/Smirnoff path, AOX1 and AOX2 newly
characterized. After the design of pairs of degenerate and specific primers for all the
enzymes of the route beyond the AOX1 and AOX2 they were used in semiquantitative
PCR reactions, using the elongation factor alpha as a constitutive elemento of reference.
The results showed that both clones decrease their levels of ascorbic acid as the fruits
develop, revealing that in all three stages of development, the Cereja clone has higher
amounts of ascorbic acid that Roxinha clone. However, when comparing the levels of
ascorbic acid between green and ripe fruits of both clones is evident that the Roxinha
clone has a lower difference between these two stages. The gene expression of three
enzymes stood out from others, these showed a synergism with the expression levels of
vitamin C contained in each tissue. In addition, gene expression in two clones showed
differences in tissues that favor of Cereja clone. They are: Mannose pyrophsphorylase,
GDP-Mannose 3’5’ epimerase and GDP-Galactose phosphorylase. With greater
emphasis on GDP-Mannose 3’5’ epimerase and GDP-Galactose phosphorylase. The
enzymes that stood out showed a higher gene expression in tissues where exactly had
more ascorbic acid accumulated, gradually reducing the expression with the degree of
fruit development, revealing that the difference occurs not only between clones, but also
in tissues clones. There were no differences in gene expression of other enzymes of the
route Wheeler/Smirnoff to justfy the levels of ascorbic acid present in the tissues and
also between clones. The analysis of gene expression of isoforms of AOX revealed that
in both clones the AOX1 gene expression increases as the fruit ripens. However, the
clone Roxinha has a higher gene expression than the clone Cereja, in all three stages of
development. The analysis of transcripts of AOX2 revealed that in Cereja clone the
gene expression decreased with fruit ripening, since in Roxinha clone the expression


xx
 

 

elevated in three developmental stages. The results cearly showed that three enzymes
are essential for biosyntesis of ascorbic acid highlighting the GDP-Mannose
3’5’epimerase and GDP-Galactose phosphrylase. Another important conclusion was
that the AOX may be owner a function not previously reported in the literature, that of
assisting in the biosyntesis of vitamin C. This may be due uncoupling promoted by the
activity of AOX causing a gradual rise of the relationship oxidized cytochrome
C/rediced cytochrome C, where the cytochrome C oxidized acts of a GalLdh substrates
in the syntesis of ascorbic acid. This fact may be explained by not only the highest
levels of AOX1 transcripts present in Roxinha clone, but the increasing pattern of gene
expression in AOX2 exatly in clone that produces less ascorbic acid and which has the
smallest difference between the stages of fruit Green and ripe fruit. In the clone Cereja,
one that synthesizes more ascorbic acid and has a huge difference in the levels between
the stages of green fruit and ripe fruit of gene expression of AOX2 shown decresing
during ripening. Thus, the concentration of products the Wheeler / Smirnoff path is still
determining the amount of ascorbic acid produced, and in parallel, the increase in the
AOX gene expression appears to contribute at some point to establish the total levels of
vitamin C synthesized.

Tipo do Trabalho:
Tese

Referência:
SARAIVA, LUIS FLÁVIO MENDES. Avaliação molecular da biossíntese de ácido ascórbico e possível participação da Oxidase alternativa em dois clones de aceroleira (Malpighia emarginata DC). . 2011. 129 f. Tese (Doutorado em 2011) - Universidade Estadual do Ceará, , 2011. Disponível em: Acesso em: 21 de junho de 2021

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