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Repositório Institucional - UECE
Título:
POLISSACARÍDEOS DA FOLHA DE Genipa americana: isolamento, caracterização química e efeitos anticoagulante, antiplaquetário, antitrombótico e anti-inflamatório

Autor(es):
MADEIRA, JULIANA DA COSTA

Palavras Chaves:
Não informado

Ano de Publicação:
2014

Resumo:
Nos últimos anos o número de casos envolvendo doenças tromboembólicas tem aumentado a
necessidade do uso de fármacos com atividade anticoagulante e antitrombótica. Além disso,
processos inflamatórios também estão associados com disfunções na hemostasia. Fármacos
anticoagulantes (heparina) e antiplaquetários (ácido acetilsalicílico e clopidogrel), são vastamente
utilizados na clínica. No entanto, muitos efeitos adversos estão associados com o seu uso, como
risco de sangramento, trombocitopenia, reações gastrointestinais e risco de reincidência de trombose.
A atividade dos polissacarídeos de plantas superiores na coagulação e trombose, diferente dos
polissacarídeos sulfatados de algas marinhas, tem sido pouco explorada, sendo seu efeito
anticoagulante é atribuído a presença de ácido urônico em sua estrutura. Na busca de fármacos
antitrombóticos com potencial anti-inflamatório, este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar
química e estruturalmente os polissacarídeos da folha de Genipa americana e avaliar seus efeitos
anticoagulante, antiplaquetário, antitrombótico e anti-inflamatório. As folhas foram coletadas no
município de Quixadá (Custódio/CE), lavadas, secas e maceradas. O pó (5 g) foi suspenso em
metanol (1:50, p/v), homogeneizado (2 h, 70 °C) e filtrado - repetido 2x. O resíduo foi suspenso em
NaOH 0,1 M (1:50, p/v), homogeneizado (2 h, 97 °C) e centrifugado (1445 x g, 15 min., TA) - repetido
3x. Os Sobrenadantes (S2 e S3) foram reunidos, neutralizados, precipitados com 4 volumes de etanol
(4 °C, 24 h) e centrifugado. O precipitado foi dialisado, centrifugado e o sobrenadante liofilizado
(polissacarídeos totais-PLT). Os PLT foram dissolvidos em água destilada (2:1, p/v) e aplicados em
cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose) equilibrada com água. A coluna foi lavada com água e
as frações acídicas eluídas com NaCl (0,1-1,0 M) e monitoradas por quanto aos teores de
carboidratos totais e ácido urônico. Os PLT e as frações polissacarídicas foram analisados quanto ao
conteúdo de carboidratos totais, ácido urônico e proteínas; eletroforese (gel de agarose e
poliacrilamida) e quanto a sua composição monossacarídica por cromatografia gasosa acoplada a
espectro de massa (GC-MS). In vitro, os polissacarídeos foram avaliados quanto à atividade
anticoagulante, pelos testes do tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPA) e o tempo de
protrombina (TP), e também quanto à atividade antiplaquetária induzida por adenosina difosfato
(ADP, 3 μM). Ratos Wistar (150-250 g) foram utilizados em modelos in vivo, nos quais os
polissacarídeos foram avaliados quanto aos seus efeitos antitrombótico (trombose venosa),
hemorrágico (tendência hemorrágica) e anti-inflamatório (peritonite). Os PLT (6,5%) e frações
polissacarídicas - FI e FII (35 e 56%) apresentaram bons rendimentos, altos teores de carboidratos
totais (23-54,6%), ácido urônico (9-30%) e baixa contaminação proteica (0,56-5%). PLT e FII, mas
não FI, apresentaram maior teor de ácido urônico, confirmado a partir da eletroforese em gel de
agarose e de poliacrilamida corada com Stainss-All. Análises da composição monossacarídica das
frações FI e FII, por GC-MS, revelaram arabinose e galactose como principais componentes. PLT não
apresentou atividade anticoagulante no teste do TP, mas prolongou o tempo de coagulação no teste
do TTPA em 3,8x (0,1 mg/mL; 140,7 ± 3,7 s) em comparação ao plasma controle (38,7 ± 0,9 s). FII foi
a fração mais anticoagulante, aumentando em até 1,8x (0,1 mg/mL; 69 ± 3,1 s) o tempo de
coagulação em relação ao plasma controle. In vitro, PLT e FI, na concentração de 100 μg/μL, inibiram
em até 48% a agregação plaquetária. In vivo, na dose de 1 mg/kg, PLT, FI e FII inibiram a formação
de trombos em 40% (2,58 ± 0,2 mg), 53% (2,14 ± 0,2 mg) e 37% (2,96 ± 0,3 mg), respectivamente,
comparado com salina (4,7 ± 0,1 mg). Nesta mesma dose, PLT e FI aumentaram o tempo de
sangramento em 3,0x (2752 ± 311,7 s) e FII em apenas 1,7x (1568 ± 159,1 s) comparado com
controle PBS (906 ± 16,7 s). Apenas FI apresentou efeito anti-inflamatório, inibindo a migração de
neutrófilos em 85% (315,8 ± 142,7 células) versus zimosan (2013 ± 308,9 células), e inibiu a
agregação plaquetária em 48% após incubação com fluido peritoneal. Em conclusão, os
polissacarídeos isolados das folhas de G. americana, ricos em arabinose, galactose e ácido urônico,
apresentaram atividade antiplaquetária, antitrombótica, anti-inflamatório e anticoagulante (com
atuação na via intrínseca e/ou comum da coagulação).
Palavras-chave: Genipa americana, polissacarídeos, anticoagulante, antiplaquetário, antiinflamatório.


Abstract:
Nowadays the number of cases involving thromboembolic diseases has increased the need for the
use of drugs with antithrombotic and anticoagulant activities. In addition, inflammatory processes are
also associated to the development of hemostasis disorders. Anticoagulant (heparin) and antiplatelet
(aspirin and clopidogrel) are widely used in clinic. However, many adverse effects are associated to its
use, such as the risk of bleeding, thrombocytopenia, gastrointestinal reactions and thrombosis
recurrent. The action of polysaccharides of higher plants in coagulation and thrombosis, unlike
sulfated polysaccharides of marine algae, has been little explored, being in general, the anticoagulant
effect is attributed to the presence of uronic acid in its structure. In the search of antithrombotic drugs
with anti-inflammatory potential, this study aimed to isolate and characterize chemically and
structurally the polysaccharides of G. americana leaves and evaluate its anticoagulant, antiplatelet,
antithrombotic and anti-inflammatory effects. Leaves were collected at Custódio-Quixadá, CE, Brazil,
washed, dried and macerated. Powder (5 g) was suspended in methanol (1:50, w/v) homogenized (2
h, 70 ° C) and filtered - repeated 2x. Residue was suspended in 0.1 M NaOH (1:50, w/v),
homogenized (2 h, 97 °C) and centrifuged (1445 x g, 15 min., r.t.) - repeated 3x. Supernatants (S2
and S3) were pooled, neutralized, precipitated with 4 volumes of ethanol (4 ° C, 24 h) and centrifuged.
Pellet was dialyzed, centrifuged and the resultant supernatant lyophilized and named Total
Polysacharides (TPL). TPL were dissolved in distilled water (2:1, w/v) and applied to ion exchange
chromatography (DEAE-cellulose) equilibrated with water. Column was washed with water, being the
acidic fractions eluted with NaCl (0.1-1.0 M) and monitored for total carbohydrate and uronic acid. TPL
and polysaccharide fractions were analyzed for total carbohydrate, uronic acid and protein content;
electrophoresis (agarose and polyacrylamide gel) and for its monosaccharide composition by gas
chromatography coupled with mass spectrum (GC-MS). In vitro polysaccharides were evaluated for its
anticoagulant activity by the Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) and the Prothrombin Time
(PT) and also for its activity on the platelet aggregation induced by adenosine diphosphate (ADP, 3
μM). Wistar rats (150-250g) were used in the in vivo models, in which polysaccharides were evaluated
for its antithrombotic (venous thrombosis), hemorrhagic (bleeding tendency) and anti-inflammatory
(peritonitis) effects. TPL (6,5%) and polysaccharide fractions - FI and FII (35 and 56%) showed high
yield and contents of total carbohydrates (23-54.6%) and uronic acid (9-30%), but low protein
contamination (0.56-5%). TPL and FII, but not FI showed high content of uronic acid, confirmed by
agarose gel electrophoresis and gel polyacrylamide stained Stainss-All. Analysis of the
monosaccharide composition of FI and FII, by GC-MS, showed arabinose and galactose as major
components. TPL showed no anticoagulant activity in the PT test, but in the APTT prolonged by 3.8x
(0.1 mg/mL; 140.7 ± 3.7 s) the clotting time compared to control plasma (38.7 ± 0.9 s). FII was the
most anticoagulant, increasing up to 1.8x (0.1 mg/mL, 69 ± 3.1 s) the coagulation time compared to
the control plasma. In vitro, PLT and FI at 100 μg/μL, inhibited platelet aggregation by 48%. In vivo, at
1 mg/kg, PLT, FI and FII inhibited thrombus formation in 40% (2.58 ± 0.2 mg), 53% (2.14 ± 0.2 mg)
and 37% (2 96 ± 0.3 mg), respectively, in comparison with saline (4.7 ± 0.1 mg). At this dose PLT and
FI increased bleeding time by 3.0x (2752 ± 311.7 s) and FII only by 1.7x (1568 ± 159.1 s) compared to
PBS (906 ± 16.7 s). FI only showed anti-inflammatory effect, inhibiting neutrophil migration by 85%
(315.8 ± 142.7 cells) versus zymosan (2013 ± 308.9 cells) and blocked platelet aggregation by 48%
after co-incubation with animals peritoneal fluid. In conclusion, the polysaccharides isolated from G.
americana leaves, rich in arabinose, galactose and uronic acid present antiplatelet, antithrombotic,
anti-inflammatory and anticoagulant (in the intrinsic/common pathway) activities.
Keywords: Genipa americana, polysaccharides, anticoagulant, antiplatelet, anti-inflammatory.

Tipo do Trabalho:
Dissertação

Referência:
MADEIRA, JULIANA DA COSTA. POLISSACARÍDEOS DA FOLHA DE Genipa americana: isolamento, caracterização química e efeitos anticoagulante, antiplaquetário, antitrombótico e anti-inflamatório . 2014. 71 f. Dissertação (Mestrado Acadêmico ou Profissional em 2014) - Universidade Estadual do Ceará, , 2014. Disponível em: Acesso em: 7 de dezembro de 2024

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