POLISSACARÍDEOS DA FOLHA DE Genipa americana: isolamento,
caracterização química e efeitos anticoagulante, antiplaquetário,
antitrombótico e anti-inflamatório
Autor(es):
MADEIRA, JULIANA DA COSTA
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2014
Resumo:
Nos últimos anos o número de casos envolvendo doenças tromboembólicas tem aumentado a necessidade do uso de fármacos com atividade anticoagulante e antitrombótica. Além disso, processos inflamatórios também estão associados com disfunções na hemostasia. Fármacos anticoagulantes (heparina) e antiplaquetários (ácido acetilsalicílico e clopidogrel), são vastamente utilizados na clínica. No entanto, muitos efeitos adversos estão associados com o seu uso, como risco de sangramento, trombocitopenia, reações gastrointestinais e risco de reincidência de trombose. A atividade dos polissacarídeos de plantas superiores na coagulação e trombose, diferente dos polissacarídeos sulfatados de algas marinhas, tem sido pouco explorada, sendo seu efeito anticoagulante é atribuído a presença de ácido urônico em sua estrutura. Na busca de fármacos antitrombóticos com potencial anti-inflamatório, este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar química e estruturalmente os polissacarídeos da folha de Genipa americana e avaliar seus efeitos anticoagulante, antiplaquetário, antitrombótico e anti-inflamatório. As folhas foram coletadas no município de Quixadá (Custódio/CE), lavadas, secas e maceradas. O pó (5 g) foi suspenso em metanol (1:50, p/v), homogeneizado (2 h, 70 °C) e filtrado - repetido 2x. O resíduo foi suspenso em NaOH 0,1 M (1:50, p/v), homogeneizado (2 h, 97 °C) e centrifugado (1445 x g, 15 min., TA) - repetido 3x. Os Sobrenadantes (S2 e S3) foram reunidos, neutralizados, precipitados com 4 volumes de etanol (4 °C, 24 h) e centrifugado. O precipitado foi dialisado, centrifugado e o sobrenadante liofilizado (polissacarídeos totais-PLT). Os PLT foram dissolvidos em água destilada (2:1, p/v) e aplicados em cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose) equilibrada com água. A coluna foi lavada com água e as frações acídicas eluídas com NaCl (0,1-1,0 M) e monitoradas por quanto aos teores de carboidratos totais e ácido urônico. Os PLT e as frações polissacarídicas foram analisados quanto ao conteúdo de carboidratos totais, ácido urônico e proteínas; eletroforese (gel de agarose e poliacrilamida) e quanto a sua composição monossacarídica por cromatografia gasosa acoplada a espectro de massa (GC-MS). In vitro, os polissacarídeos foram avaliados quanto à atividade anticoagulante, pelos testes do tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPA) e o tempo de protrombina (TP), e também quanto à atividade antiplaquetária induzida por adenosina difosfato (ADP, 3 μM). Ratos Wistar (150-250 g) foram utilizados em modelos in vivo, nos quais os polissacarídeos foram avaliados quanto aos seus efeitos antitrombótico (trombose venosa), hemorrágico (tendência hemorrágica) e anti-inflamatório (peritonite). Os PLT (6,5%) e frações polissacarídicas - FI e FII (35 e 56%) apresentaram bons rendimentos, altos teores de carboidratos totais (23-54,6%), ácido urônico (9-30%) e baixa contaminação proteica (0,56-5%). PLT e FII, mas não FI, apresentaram maior teor de ácido urônico, confirmado a partir da eletroforese em gel de agarose e de poliacrilamida corada com Stainss-All. Análises da composição monossacarídica das frações FI e FII, por GC-MS, revelaram arabinose e galactose como principais componentes. PLT não apresentou atividade anticoagulante no teste do TP, mas prolongou o tempo de coagulação no teste do TTPA em 3,8x (0,1 mg/mL; 140,7 ± 3,7 s) em comparação ao plasma controle (38,7 ± 0,9 s). FII foi a fração mais anticoagulante, aumentando em até 1,8x (0,1 mg/mL; 69 ± 3,1 s) o tempo de coagulação em relação ao plasma controle. In vitro, PLT e FI, na concentração de 100 μg/μL, inibiram em até 48% a agregação plaquetária. In vivo, na dose de 1 mg/kg, PLT, FI e FII inibiram a formação de trombos em 40% (2,58 ± 0,2 mg), 53% (2,14 ± 0,2 mg) e 37% (2,96 ± 0,3 mg), respectivamente, comparado com salina (4,7 ± 0,1 mg). Nesta mesma dose, PLT e FI aumentaram o tempo de sangramento em 3,0x (2752 ± 311,7 s) e FII em apenas 1,7x (1568 ± 159,1 s) comparado com controle PBS (906 ± 16,7 s). Apenas FI apresentou efeito anti-inflamatório, inibindo a migração de neutrófilos em 85% (315,8 ± 142,7 células) versus zimosan (2013 ± 308,9 células), e inibiu a agregação plaquetária em 48% após incubação com fluido peritoneal. Em conclusão, os polissacarídeos isolados das folhas de G. americana, ricos em arabinose, galactose e ácido urônico, apresentaram atividade antiplaquetária, antitrombótica, anti-inflamatório e anticoagulante (com atuação na via intrínseca e/ou comum da coagulação). Palavras-chave: Genipa americana, polissacarídeos, anticoagulante, antiplaquetário, antiinflamatório.
Abstract:
Nowadays the number of cases involving thromboembolic diseases has increased the need for the use of drugs with antithrombotic and anticoagulant activities. In addition, inflammatory processes are also associated to the development of hemostasis disorders. Anticoagulant (heparin) and antiplatelet (aspirin and clopidogrel) are widely used in clinic. However, many adverse effects are associated to its use, such as the risk of bleeding, thrombocytopenia, gastrointestinal reactions and thrombosis recurrent. The action of polysaccharides of higher plants in coagulation and thrombosis, unlike sulfated polysaccharides of marine algae, has been little explored, being in general, the anticoagulant effect is attributed to the presence of uronic acid in its structure. In the search of antithrombotic drugs with anti-inflammatory potential, this study aimed to isolate and characterize chemically and structurally the polysaccharides of G. americana leaves and evaluate its anticoagulant, antiplatelet, antithrombotic and anti-inflammatory effects. Leaves were collected at Custódio-Quixadá, CE, Brazil, washed, dried and macerated. Powder (5 g) was suspended in methanol (1:50, w/v) homogenized (2 h, 70 ° C) and filtered - repeated 2x. Residue was suspended in 0.1 M NaOH (1:50, w/v), homogenized (2 h, 97 °C) and centrifuged (1445 x g, 15 min., r.t.) - repeated 3x. Supernatants (S2 and S3) were pooled, neutralized, precipitated with 4 volumes of ethanol (4 ° C, 24 h) and centrifuged. Pellet was dialyzed, centrifuged and the resultant supernatant lyophilized and named Total Polysacharides (TPL). TPL were dissolved in distilled water (2:1, w/v) and applied to ion exchange chromatography (DEAE-cellulose) equilibrated with water. Column was washed with water, being the acidic fractions eluted with NaCl (0.1-1.0 M) and monitored for total carbohydrate and uronic acid. TPL and polysaccharide fractions were analyzed for total carbohydrate, uronic acid and protein content; electrophoresis (agarose and polyacrylamide gel) and for its monosaccharide composition by gas chromatography coupled with mass spectrum (GC-MS). In vitro polysaccharides were evaluated for its anticoagulant activity by the Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) and the Prothrombin Time (PT) and also for its activity on the platelet aggregation induced by adenosine diphosphate (ADP, 3 μM). Wistar rats (150-250g) were used in the in vivo models, in which polysaccharides were evaluated for its antithrombotic (venous thrombosis), hemorrhagic (bleeding tendency) and anti-inflammatory (peritonitis) effects. TPL (6,5%) and polysaccharide fractions - FI and FII (35 and 56%) showed high yield and contents of total carbohydrates (23-54.6%) and uronic acid (9-30%), but low protein contamination (0.56-5%). TPL and FII, but not FI showed high content of uronic acid, confirmed by agarose gel electrophoresis and gel polyacrylamide stained Stainss-All. Analysis of the monosaccharide composition of FI and FII, by GC-MS, showed arabinose and galactose as major components. TPL showed no anticoagulant activity in the PT test, but in the APTT prolonged by 3.8x (0.1 mg/mL; 140.7 ± 3.7 s) the clotting time compared to control plasma (38.7 ± 0.9 s). FII was the most anticoagulant, increasing up to 1.8x (0.1 mg/mL, 69 ± 3.1 s) the coagulation time compared to the control plasma. In vitro, PLT and FI at 100 μg/μL, inhibited platelet aggregation by 48%. In vivo, at 1 mg/kg, PLT, FI and FII inhibited thrombus formation in 40% (2.58 ± 0.2 mg), 53% (2.14 ± 0.2 mg) and 37% (2 96 ± 0.3 mg), respectively, in comparison with saline (4.7 ± 0.1 mg). At this dose PLT and FI increased bleeding time by 3.0x (2752 ± 311.7 s) and FII only by 1.7x (1568 ± 159.1 s) compared to PBS (906 ± 16.7 s). FI only showed anti-inflammatory effect, inhibiting neutrophil migration by 85% (315.8 ± 142.7 cells) versus zymosan (2013 ± 308.9 cells) and blocked platelet aggregation by 48% after co-incubation with animals peritoneal fluid. In conclusion, the polysaccharides isolated from G. americana leaves, rich in arabinose, galactose and uronic acid present antiplatelet, antithrombotic, anti-inflammatory and anticoagulant (in the intrinsic/common pathway) activities. Keywords: Genipa americana, polysaccharides, anticoagulant, antiplatelet, anti-inflammatory.
Tipo do Trabalho:
Dissertação
Referência:
MADEIRA, JULIANA DA COSTA. POLISSACARÍDEOS DA FOLHA DE Genipa americana: isolamento,
caracterização química e efeitos anticoagulante, antiplaquetário,
antitrombótico e anti-inflamatório
. 2014. 71 f. Dissertação (Mestrado Acadêmico ou Profissional em 2014) - Universidade Estadual do Ceará, , 2014. Disponível em: Acesso em: 7 de dezembro de 2024
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