CULTIVO E CRIOPRESERVAÇÃO DE FIBROBLASTOS DE VEADO-CATINGUEIRO (Mazama gouazoubira Fischer, 1814) E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS SOMÁTICAS INTERESPECÍFICA (TNCSi)
Autor(es):
MAGALHÃES, LÍVIA CORREIA
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
Não informado
Resumo:
RESUMO
O veado-catingueiro (Mazama gouazoubira) é uma espécie de cervídeo que vem sofrendo riscos à sobrevivência devido à caça furtiva e perda de habitat. Nesse sentido, estudos têm demonstrado que algumas espécies podem se beneficiar da tecnologia de transferência nuclear de célula somática interespecífica (TNCSi). Para isto, é necessário um prévio estabelecimento de cultivo e sincronização de células somáticas, para que estas sejam utilizados como carioplasto em uma das etapas da técnica. Este trabalho teve como objetivo verificar a viabilidade de fibroblastos de M. gouazoubira após diferentes passagens de cultivo celular e criopreservação. Além disso, avaliar o desenvolvimento in vitro de embriões clones produzidos por TNCSi utilizando citoplasto bovino ou caprino e em seguida, observar os níveis de expressão dos genes mitocondriais. No primeiro estudo, os fibroblastos foram cultivados até as passagens 4, 7 e 10 (subdivididas em grupo controle e grupo congelado/descongelado), avaliadas quanto à viabilidade celular, funcionalidade e porcentagem de células em necrose e apoptose. As taxas de sobrevivência foram sempre superiores a 80% independentemente do grupo testado, com exceção da passagem 10 no grupo congelado/descongelado. O tempo de duplicação de população (PDT) das células cultivadas a partir da passagem 10 foi significativamente maior do que as passagens 4 e 7, apresentando baixa atividade metabólica e maior porcentagem de células em apoptose inicial. No segundo estudo, os embriões clones de veado-catingueiro foram reconstruídos utilizando citoplasto caprino ou bovino, como controle foram produzidos embriões clones de caprino e bovino, respectivamente, e um grupo de embriões produzidos por fecundação in vitro (FIV) em bovino. Em seguida, os embriões obtidos foram submetidos à análise de expressão dos genes ATP6, COX3 e ND5, tendo como referência um gene nuclear (GAPDH) ou mitocondrial (16S). Não houve diferença (p > 0,05) no desenvolvimento embrionário entre TNCS e TNCSi, utilizando citoplasto caprino (38,4% e 25% de taxa de clivagem e 40% e 50% de taxa de mórulas, respectivamente) e citoplasto bovino (72,8% e 65,5% de taxa de clivagem e 11,3% e 5,9% de taxa de blastocistos, respectivamente). Os perfis de expressão variaram de acordo com a referência nuclear ou mitocondrial. Nos embriões clones de caprino e cervídeo, não houve diferença significativa para o gene ATP6 (p > 0,05), independente do gene de referência. Para os grupos FIV, clone de
bovino e clone de cervídeo, quando a referência foi o gene 16S, observou-se diferença (p < 0,05) para COX3. Quando GAPDH foi referência, o grupo clone de cervídeo mostrou aumento na expressão de todos os genes avaliados quando comparados ao grupo FIV (p < 0,05). No entanto, foi estatisticamente semelhante (p > 0,05) ao grupo bovino/bovino para os genes COX3 e ND5. Em conclusão, este trabalho demonstrou que existe um efeito deletério do número de passagens sobre a qualidade dos fibroblastos criopreservados de veado-catingueiro. Adicionalmente, citoplastos caprinos e bovinos foram eficientes para a produção de embriões clones desta espécie por TNCSi, podendo servir em programas de conservação da mesma ou como modelo para outras espécies de cervídeo em real risco de extinção.
The brown brocket deer (Mazama gouazoubira) is a sepecie of deer that has been at risk of survival due to hunting and loss of habitat. In this sense, studies have already shown that some species may benefit from interspecific somatic cell nuclear transfer (iSCNT) technology. For this, a prior establishment of somatic cell culture and synchronization is necessary, so that they are used as a carioplast in one of technique step. The objective of this study was to verify if viability of M. gouazoubira fibroblasts after several cell culture passages and cryopreservation. In addition, we evaluate the in vitro development of cloned embryo produced by iSCNT using cattle or goat cytoplast and then observe the expression levels of mitochondrial genes. In the first study, the fibroblasts were cultured until 4, 7 and 10 passage (subdivided into cultured and frozen/warmed group), evaluated for cell viability, functionality and percentage of cells in necrosis and apoptosis. Survival rates were always greater than 80% regardless of the group tested, except for passage 10 in the frozen/warmed group. The population doubling time (PDT) of cells cultured from passage 10 was significantly higher than passages 4 and 7, exhibiting low metabolic activity and higher percentage of cells in initial apoptosis. In the second study, the brown brocket deer cloned embryos were first reconstructed using goat or cattle cytoplast, as controls were reassembled cloned embryos from goats and cattle, respectively, and a group with in vitro fertilized (IVF) cattle embryos. Afterwards, the embryos were submitted to expression level analysis of ATP6, COX3 and ND5 genes, based on a nuclear (GAPDH) or mitochondrial (16S) gene. There was no difference (p > 0.05) in the embryonic development between SCNT and iSCNT embryos using goat cytoplast (38.4% and 25% cleavage rate and 40% and 50% morula rate, respectively) and bovine cytoplast (72.8 % and 65.5% cleavage rate and 11.3% and 5.9% blastocyst rate, respectively). Expression profiles varied according to nuclear or mitochondrial reference. In cloned embryos of goats and deer there was no significant difference for ATP6 gene (p > 0.05), irrespective of the reference gene. For the IVF, cloned cattle and cloned deer groups, when the reference was the 16S, a difference (p < 0.05) for COX3 was observed. When GAPDH was a reference, the cloned deer group showed increased expression of all evaluated genes when compared to the IVF group (p < 0.05). However, it was statistically similar (p > 0.05) to the cloned cattle group for COX3 and ND5 genes. This work has demonstrated that there is a deleterious effect of
the number of passages on the quality of brown brocket deer cryopreserved fibroblasts. In addition, goat and cattle cytoplasts were efficient for the production of cloned embryos of this species by SCNTi, being able to serve in conservation programs of the same or as a model for other cervidae species in real danger of extinction.
MAGALHÃES, LÍVIA CORREIA. CULTIVO E CRIOPRESERVAÇÃO DE FIBROBLASTOS DE VEADO-CATINGUEIRO (Mazama gouazoubira Fischer, 1814) E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS SOMÁTICAS INTERESPECÍFICA (TNCSi). 2017. Sem Numeração Tese (Doutorado em 2017) - Universidade Estadual do Ceará, , 2017. Disponível em: Acesso em: 7 de maio de 2024
Universidade Estadual do Ceará - UECE | Departamento de Tecnologia da Informação e Comunicação - DETIC
Política de Privacidade e Segurança Build 1
