CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS EQUINOS INCLUSOS EM TECIDO OVARIANO: BENEFÍCIOS DA SUPLEMENTAÇÃO CONCENTRAÇÃODEPENDENTE DA INSULINA, HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE E FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL
Autor(es):
AGUIAR, FRANCISCO LÉO NASCIMENTO DE
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2016
Resumo:
O principal objetivo desta tese foi estudar o efeito concentração-dependente dos hormônios insulina, hormônio folículo estimulante (FSH), bem como do fator de crescimento epidermal (EGF) no cultivo in vitro (CIV) de folículos pré-antrais equinos inclusos em tecido ovariano, avaliando os parâmetros morfologia e desenvolvimento folicular, produção hormonal (todas as fases), espécies reativas de oxigênio (ROS) (Fases I, II, III), perfil metabolômico (Fase III), níveis de apoptose, expressão proteíca para Ki-67 e para o receptor de EGF, bem como níveis de mRNA para GDF-9, BMP-15 e Cyclin-D2 (Fase IV). Para isso, fragmentos ovarianos equinos foram cultivados em 4 diferentes condições: CIV utilizando meio de base (α-MEM+) na ausência ou presença de suplementação com insulina em concentração fisiológica (10 ng/mL) ou suprafisiológica (10 μg/mL) (Fase I); CIV em meio de base suplementado com diferentes concentrações (0, 10, 50 e 100 ng/mL) de FSH (Fase II) ou EGF (Fase III); e CIV usando um meio de base (α-MEM+) enriquecido com insulina (10 ng/mL) e EGF (50 ng/mL), na ausência ou presença de FSH (50 ng/mL) (Fase IV). A duração do cultivo foi de até 7 dias (Fases I, II e III) e de 15 dias (Fase IV). Na Fase I, observou-se que a concentração fisiológica de insulina (10 ng/mL) apresentou maiores (P < 0,05) percentagens de folículos morfologicamente normais e em desenvolvimento quando comparado aos demais tratamentos, após 7 dias de cultivo. Independente do período de cultivo, a produção de ROS foi menor (P < 0,05) no tratamento 10 ng/mL de insulina. O hormônio folículo estimulante na concentração de 50 ng/mL apresentou maior (P < 0,05) percentagem de folículos morfologicamente
normais e em desenvolvimento, bem como maior diâmetro folicular do que os demais tratamentos após 7 dias de cultivo (Fase II). Adicionalmente, esta concentração de FSH manteve (P > 0,05) a produção de estradiol e de ROS ao longo do cultivo. De maneira geral, o uso de EGF na concentração de 50 ng/mL resultou em maior (P < 0,05) percentagem de folículos morfologicamente normais e em desenvolvimento, bem como maiores (P < 0,05) diâmetros folicular e oocitário após 7 dias de cultivo (Fase III). Além disso, a referida concentração de EGF manteve a produção de ROS ao longo do cultivo. A análise do perfil metabolômico do meio de cultivo após 7 dias revelou a presença de três substâncias (Dinex, Leonuriside A e Avobenzene) com potencial efeito negativo na sobrevivência, bem como sobre o diâmetro folicular e oocitário. Finalmente, independente da suplementação com FSH, o uso de um meio enriquecido contendo concentrações apropriadas de insulina e EGF manteve os níveis de apoptose do tecido ovariano cultivado similares ao controle fresco não cultivado após 15 dias de cultivo (Fase IV). A expressão proteíca para EGFR, Ki-67 e os níveis de RNAm para GDF-9 e Cyclin-D2 não diferiram entre os grupos tratados após 15 dias. Concluiu-se assim que: as concentrações de insulina (10 ng/mL), FSH (50 ng/mL) e EGF (50 ng/mL) são benéficas ao CIV FOPAs equinos inclusos em tecido ovariano por até 7 dias; e que um meio enriquecido contendo insulina e EGF manteve a morfologia e funcionalidade do tecido ovariano equino após 15 dias de cultivo, independente da adição de FSH.
The main goal of this dissertation was to study the concentration-dependent effect of the hormones insulin and follicle stimulating hormone (FSH), as well as of the epidermal growth factor (EGF) on the in vitro culture (IVC) of equine preantral follicles (PAFs) enclosed in ovarian tissue. The following endpoints were evaluated: morphology, follicle development, hormonal (all phases), reactive oxygen species (ROS) production (Phase I, II, III), metabolomics profile (Phase III), and apoptotic levels, expression (protein) of EGF receptors and Ki-67, as well as mRNA levels of GDF-9, BMP-15 and Cyclin-D2 (Phase IV). Hence, equine ovarian fragments were cultured in vitro in four different conditions: IVC using base medium (α-MEM+) in the absence or presence of insulin supplementation in a physiological concentration (10 ng/mL) or supraphysiological (10 μg/mL) (Phase I); IVC in base medium supplemented with different concentrations (0, 10, 50 and 100 ng/mL) of FSH (Phase II) or EGF (Phase III); and IVC using a base medium (α-MEM+) enriched with insulin (10 ng/mL) and EGF (50 ng/mL), in the absence or presence of FSH (50 ng/mL) (Phase IV). The culture time lasted 7 days (Phases I, II, and III), and 15 days (Phase IV). In the Phase I, we observed that physiological concentration of insulin (10 ng/mL) had higher rates (P < 0.05) percentage of both morphologically normal and developing follicles when compared to the other treatments after 7 days of culture. Regardless culture time, ROS production was lower (P < 0.05) in the 10 ng/mL insulin treatment. Follicle stimulating hormone at 50 ng/mL had higher (P < 0.05) percentage of both morphologically normal and development follicles, as well as greater (P < 0.05) follicular diameter than the other treatments after 7 days of culture (Phase II). In addition, this FSH concentration maintained (P > 0.05) estradiol and ROS during culture. Overall, the use of EGF at 50 ng/mL resulted in higher (P < 0.05) percentage of morphologically normal and developing follicles, greater (P < 0.05) follicular and oocyte diameters after 7 days of culture (Phase III). In addition, the aforementioned concentration of EGF maintained ROS production during culture. The metabolomics profile of culture medium from Day 7 of culture demonstrated the presence of three substances (Dinex, Leonuriside A, and Avobenzene) with a potential negative effect on follicle survival, as well as follicular and oocyte diameters. Finally, regardless the FSH supplementation, the use of an enriched medium containing appropriate concentration of insulin and EGF maintained the apoptotic levels in the ovarian cultured tissue similar to fresh noncultured control after 15 days of culture (Phase IV). The protein expression for EGFR, Ki-67 and the mRNA levels of GDF-9 and Cyclin-D2 did not differ between the treated groups after 15 days of culture. In conclusion, the concentrations of insulin (10 ng/mL), FSH (50 ng/mL), and EGF (50 ng/mL) were beneficial for IVC of equine PAF enclosed in ovarian tissue at least for seven days, and an enriched medium containing insulin and EGF maintained the morphology and functionality of the ovarian tissue after 15 days of culture regardless the FSH addition.
AGUIAR, FRANCISCO LÉO NASCIMENTO DE. CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS EQUINOS INCLUSOS EM TECIDO OVARIANO: BENEFÍCIOS DA SUPLEMENTAÇÃO CONCENTRAÇÃODEPENDENTE DA INSULINA, HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE E FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL. 2016. 203 f. Tese (Doutorado em 2016) - Universidade Estadual do Ceará, , 2016. Disponível em: Acesso em: 7 de maio de 2024
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