Desde o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante no século passado, grandes passos foram dados nas áreas de biotecnologia e biomedicina, sendo a produção de proteínas recombinantes para fins terapêuticos uma das maiores inovações na indústria biotecnológica e farmacêutica. Neste contexto, o desenvolvimento de organismos transgênicos emerge como um componente chave na busca por melhorias no processo de produção de proteínas recombinantes. A plataforma animal, baseada no uso de animais transgênicos como biorreatores, é considerada um dos maiores sucessos da biotecnologia, oferecendo possibilidades atrativas, como baixo custo de produção e alta produtividade e qualidade das proteínas recombinantes. Tendo em vista a produção de proteínas recombinantes na plataforma animal, a glândula mamária é considerada o melhor órgão para essa finalidade, uma vez que o mesmo é especializado em síntese proteica, caracterizando-se como um excelente biorreator. Nas últimas duas décadas muitos animais domésticos transgênicos foram desenvolvidos para produzir proteínas para fins terapêuticos na glândula mamária e em outros fluidos corporais. Apesar do sucesso da transgenia em grandes animais, ainda estamos longe de uma situação ideal, já que muitos eventos durante esse processo ainda não podem ser completamente controlados. Normalmente, os transgenes são integrados em locais aleatórios no genoma então, a expressão e secreção da proteína recombinante podem variar devido a efeitos de posição, como silenciamento gênico. Uma abordagem para ajudar a resolver parte dos problemas relacionados com o desenvolvimento de animais fundadores de linhagens transgênicas, consiste em dirigir a inserção do transgene para sítios específicos no genoma, conhecidos como safe harbor loci (SHL), o que pode assegurar uma boa expressão da proteína recombinante. Os recentes avanços no desenvolvimento de ferramentas para edição de genoma, como CRISPR/Cas9, tem liderado uma revolução na engenharia genética, permitindo que as alterações sitio-dirigidas no genoma sejam feitas com relativa facilidade, como a inserção de transgenes em SHL por recombinação homóloga. Adicionalmente, além do desenvolvimento de animais transgênicos, vetores virais como lentivírus e adenovírus, têm sido extensivamente utilizados na transferência de genes para a produção de proteínas recombinantes in vitro e in vivo. Ambos os sistemas apresentam uma estratégia racional para testar a viabilidade da expressão da proteína em antes do desenvolvimento de animais transgênicos. No estudo desenvolvido nesta tese, foram identificados com sucesso dois safe harbor loci no genoma bovino, H11 e ROSA26, onde em cada locus se inseriu um transgene de 5.5 kb por recombinação homóloga, comprovando que ambos são aptos à inserção e expressão de transgenes. Também se avaliou a eficácia de duas moléculas, SCR7 e RS-1, como potenciais enhancers da via de reparo por recombinação homóloga, objetivando aumentar as taxas de inserção sítio dirigida. Contudo, não foi observado aumento na frequência de recombinação homóloga ao se utilizar ambas as moléculas. Em conjunto, os estudos desenvolvidos nesta tese podem auxiliar e melhorar o processo de transgenia em grandes animais, garantindo a inserção do transgene em safe harbor loci por recombinação homóloga, minimizando a possibilidade de efeitos indesejáveis, como silenciamento gênico.

Palavras-chave: Transgenia. Safe harbor loci. CRISPR/Cas9. Recombinação homóloga. Proteína recombinante.

Since the development of the recombinant DNA technology in the past century, great steps have been achieved in the biotechnology and biomedicine field. The recombinant production of therapeutic proteins for human or animal health is currently the largest source of innovation in the biotech and pharmaceutical industry. Paving the road toward the improvement of the recombinant protein production, transgenesis emerges as a key component. The animal platform, based on the use of transgenic animals as bioreactors, is one of the major successes in biotechnology, offering attractive possibilities, as low production costs and high productivity and quality of recombinant proteins. As animal platform goes for recombinant protein production, the mammary gland has been considered the best tissue to that end, since that organ is specialized in protein synthesis, consisting in an excellent bioreactor path. Many transgenic domestic animals have been developed to produce therapeutic proteins in the mammary gland or other body fluids, and this approach is one of the most important methods for agricultural and biomedical applications. Despite the great success in developing transgenic livestock, we are still far from an ideal situation, since many events during this process cannot be controlled. Usually, transgenes are integrated at random sites in the genome then, the expression and secretion of the protein can vary due to position effects, such as gene silencing. An approach to overcome part of the problems regarding to the development of transgenic founder animals, is to direct the transgene to specific sites in the genome, known as safe harbor loci, which could ensure a safe profile for the protein expression. Recent advances in the ability to design DNA binding factors with specificity for desired sequences, as CRISPR/Cas9, have resulted in a revolution in genetic engineering, enabling directed changes to the genome to be made relatively easily, as the insertion of transgenes in safe harbor loci by homologous recombination. In addition, besides the development of transgenic animals, viral vectors as lentivirus and adenovirus have been used as gene transfer units for recombinant protein production in vitro and in vivo. Both systems present a rational strategy for the fast and easy production of foreign proteins prior the development of transgenic founders, aiming to test the feasibility of the protein production. Herein, we successfully targeted two safe harbor loci in the bovine genome, H11 and ROSA26, and inserted a 5.5 kb transgene by homologous recombination (HR), proven that both loci can harbor transgene insertion and expression. We also evaluated the efficacy of two small molecules, SCR7 and RS-1, as enhancer of the HR repair pathway, aiming to improve the sites-specific insertion by this path, but we have not seen any improvement when using both molecules. Taken together, the rationales used in this thesis could help and improve the transgenesis process in large aiming the development of the transgenic animals, with the site-specific transgene insertion by homologous recombination in safe harbor loci.

Keywords: Transgenesis. Safe harbor loci. Homologous recombination. CRISPR/Cas9. Recombinant protein.