Desenvolvimento de imunossensores para detecção de troponina T cardíaca humana
Autor(es):
Mattos, Alessandra Batista de
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2011
Resumo:
A troponina T (TnT) é um marcador cardíaco considerado "padrão ouro" para o diagnóstico do infarto
agudo do miocárdio. Métodos analíticos para melhorar o diagnóstico desta doença são importantes
para o tratamento adequado dos pacientes. Atualmente, as técnicas baseadas em imunoensaios são as
mais utilizadas para diagnóstico clínico e determinação da TnT. Neste contexto, os imunossensores
surgem como uma poderosa ferramenta de baixo custo com alta sensibilidade e especificidade. Nesta
tese foram desenvolvidos três diferentes imunosensores para a detecção da TnT em soro humano. O
primeiro imunossensor foi baseado em eletrodos impressos usando a transdução eletroquímica,
visando o desenvolvimento de testes point-of-care. Os eletrodos impressos foram fabricados com um
composto de grafite e prata epóxi seguidos por uma integração de microesferas de estreptavidina
ligadas ao anticorpo biotinilado contra a TnT (anti-TnT). No imunossensor eletroquímico para a
detecção da TnT, um imunoensaio completo do tipo “sanduíche” foi realizado, no qual a captura
específica da TnT foi avaliada através das reações redox da enzima peroxidase conjugada ao segundo
anticorpo anti-TnT. De acordo com os resultados, foi observado que o uso de microesferas de
estreptavidina aumentou significativamente a sensibilidade analítica do eletrodo em 8,5 vezes,
mostrando uma curva com uma faixa de resposta linear entre 0,1 e 10 ng mL-1 de TnT e um limite de
detecção de 0,2 ng mL-1. O segundo imunossensor foi baseado em uma monocamada auto-organizada
formada por cisteamina para imobilizar o anti-TnT, usando uma microbalança de cristal de quartzo.
Neste imunossensor, a alteração de freqüência foi obtida pela variação de massa na superfície de ouro
do cristal de quartzo quando a TnT presente no soro se liga e ao anti-TnT imobilizado. O anti-TnT foi
imobilizado na superfície aminada via glutaraldeído. De acordo com os resultados, uma boa correlação
foi encontrada entre a concentração de TnT e a mudança de freqüência, mostrando um bom limite de
detecção (0,008 ng mL-1). A aplicação deste imunossensor para amostras clínicas demonstrou que os
resultados tiveram boa concordância com os imunoensaios convencionais. Finalmente, o terceiro
imunossensor foi baseado na formação de um filme polimérico sobre o eletrodo de carbono vítreo
usando a transdução eletroquímica. O ácido orto-aminobenzóico (o-ABA) foi eletropolimerizado
sobre a superfície do eletrodo. O filme polimérico de poli(o-ABA) foi estrategicamente usado por
deixar a superfície eletródica com grupamentos carboxilícos para ligar o anti-TnT . De acordo com os
resultados, os eletrodos mostraram uma boa estabilidade nas respostas analíticas mantendo 91,6% da
sua resposta inicial após 18 dias e bom limite de detecção (0,015 ng mL-1). Em conclusão, os
imunossensores desenvolvidos demonstraram alta sensibilidade, permitindo medidas confiáveis da
TnT em níveis de importância clínica para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio.
Palavras-chave: infarto agudo do miocárdio; troponina T; imunoensaio; imunossensor.
Abstract:
Troponin T (cTnT) is a cardiac marker considered “gold standard” for acute myocardial infarction
diagnosis. Analytical methods to improve the diagnosis of this disease are important to appropriate
treatment of patients. Currently, the techniques based on immunoassays are the most frequently used
for clinical diagnosis and determination of cTnT. In this context, the immunosensors emerge as a
powerful tool of low cost with high sensitivity and specificity. In this thesis, three different
immunosensors were developed for the detection of TnT in human serum. The first immunosensor
was based in screen-printed electrodes using electrochemical transduction, aiming the point-of-care
tests development. The screen‒printed electrodes were manufactured with silver-epoxy and graphite
composite followed by an integration of streptavidin microsphere linked to the biotinylated
monoclonal antibody against cTnT (mAb-cTnT). In the electrochemical immunosensor for the
detection of TnT, an "sandwich" immunoassay was carried out, in which the specific capture of TnT
was evaluated by the redox reactions of the peroxidase enzyme conjugated to second anti-TnT
antibody. According to the results, it was observed that the use of streptavidin microspheres
significantly increased the analytical sensitivity of the electrode in 8.5 times, showing a curve with a
linear response range between 0.1 and 10 ng mL−1 of cTnT and a detection limit of 0.2 ng mL−1. The
second immunosensor was based on a self-assembled monolayer formed by cysteamine to immobilize
the mAb-cTnT using quartz crystal microbalance. In this immunosensor, the change of frequency was
obtained by varying of the mass on the gold surface of the quartz crystal when the cTnT present in the
serum binds to immobilized mAb-cTnT. The mAb-cTnT was immobilized on the amine-coated
surface via glutaraldehyde. According to the results, a good correlation was found between the cTnT
concentration and the frequency shift showing a good detection limit (0.008 ng mL-1). Application of
this immunosensor to clinical samples demonstrated that the results had good agreement with
conventional immunoassays. Finally, the third immunosensor was based on the formation of a
polymer film on the glassy carbon electrode using electrochemical transduction. The orthoaminobenzoic acid (o-ABA) was electropolymerized on the electrode surface. The polymer film of
poly(o-ABA) was strategically used to bind anti-cTnT. According to the results, the electrodes showed
a good stability in the analytical response retaining 91.6% of its initial response after 18 days and good
detection limit (0.015 ng mL-1). In conclusion, the developed immunosensors showed a high
sensitivity, allowing reliable measurements of the cTnT at levels of clinical significance for the
diagnosis of acute myocardial infarction.
Keywords: acute infarction diagnosis; troponin T; immunoassay; immunosensor.
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Mattos, Alessandra Batista de. Desenvolvimento de imunossensores para detecção de troponina T cardíaca humana. 2011. 125 f. Tese (Doutorado em 2011) - Universidade Estadual do Ceará, , 2011. Disponível em: Acesso em: 6 de maio de 2024
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