Caracterização genética, produção de biopolímeros extracelulares e proteoma de bactérias diazotróficas
Autor(es):
Oliveira, José de Paula
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2011
Resumo:
Os exopolissacarídeos microbianos vêm sendo estudados cada vez mais devido
as suas propriedades reológicas que em determinados casos superam as características
funcionais dos polissacarídeos de origem vegetal, além das seguintes vantagens:
produção independente de condições climáticas, possibilidade de utilização de matériasprimas regionais, maior rapidez na obtenção do produto acabado e necessidade de
espaço relativamente pequeno para a sua produção. Esse trabalho teve como objetivos
caracterizar as estirpes IPA 403 e IPA 49 por análises da região 16S rDNA amplificada
por reação em cadeia da polimerase (PCR); usada como padrão de Rhizobium tropici a
estirpe CIAT 899 (CIAT – Colômbia); avaliar a produção de biopolímeros, composição
química e reologia das estirpes citadas acima nos tempos de 132 , 144 e 168 horas de
cultivo e identificar proteínas solúveis intracelulares por meio de técnicas de 2D -
PAGE e espectrometria de massa no tempo de 168 horas de cultivo. As estirpes (IPA
403 e IPA 49) foram isoladas do Semi - Árido de Pernambuco – Região do Araripe
foram realizadas através da comparação das sequencias parciais dos genes 16S rDNA.
A reação em cadeia da polimerase foi realizada utilizando os oligonucleotídeos
iniciadores de reação Y1 e Y3 desenvolvidos para amplificação parcial do gene 16S
rRNA de rizóbios. A reação de PCR foi conduzida em um termociclador com a seguinte
programação: desnaturação inicial a 94o C por 2 min; 29 ciclos de desnaturação (94o C
por 45 s), anelamento (50o C por 45 s) e extensão (72o C por 1 min) e uma extensão final
a 72o C por 2 min. A recuperação dos biopolímeros foi realizada através da precipitação
com álcool etílico (PA) na proporção de 1:3 (v/v) e a produção foi obtida avaliando-se a
massa do produto seco por volume de meio de cultivo. A viscosidade foi determinada
em um viscosímetro com taxa de cisalhamento variando entre 39,6 S-1 a 165 S-1 e
viscosidade de 1,5 mPa.s. Foram realizados os teores de ácido pirúvico e acetil, e a
composição química foi obtida através de cromatografia em camada delgada
comparativa. Com base em 99 % de similaridade as análises das seqüências parciais do
gene 16S rDNA confirmaram que as estirpes estudadas pertencem a espécie Rhizobium
tropici. Quanto à produção de biopolímero a estirpe IPA 403 foi superior em relação às
estirpes CIAT 899 e IPA 49, 25,44 g/L, 17,15 g/L e 11,25 g/L respectivamente, no
tempo de 168 horas de cultivo. Com relação ao comportamento reológico dos
biopolímeros produzidos a estirpe IPA 403 obteve a maior viscosidade (224 mPa.s.)
entre as estirpes estudadas. Quanto a composição química dos biopolímeros a estirpe
IPA 49 obteve a maior percentagem de acetil e ácido pirúvico, 5,60 % e 7,00 %
respectivamente. Com relação aos teores de açucares presentes nos biopolímeros todas
as estirpes apresentaram galactose e glicose. A fucose só foi identificada nas estirpes
CIAT 899 e IPA 49 enquanto que o ácido urônico só foi detectado na estirpe IPA 403.
A análise proteômica dos metabólitos produzidos pelas estirpes CIAT 899, IPA 403 e
IPA 49 em 168 horas de cultivo apresentaram diversas proteínas dentre elas elongation
factor TU, chaperona, GroEL / GroEs, glicosiltransferase (putative glycosyltransferase)
que tem como uma das funções catalisar a produção de polissacarídeos. As
dinitrogenase e nitrogenase ferro proteínas estão envolvidas no processo de redução do
nitrogênio atmosférico fazendo parte do complexo da nitrogenase. A proteína
glyceraldeideo-3-fosfato dehidrogenase do complexo energético está envolvida na
glicólise, além de outras duas proteínas a eletron transfer flavoproteina beta subunit e
dehidrogenase. Os resultados permitiram avaliar a qualidade do biopolímero produzido
pelas estirpes utilizadas no experimento e de seu proteoma ao final de 168 horas de
cultivo.
Palavras chave: Rhizobium; exopolissacarídeos; 16S rDNA; composição química;
proteoma.
Abstract:
The microbial exopolysaccharides are being increasingly studied due to their
rheological properties that in some cases exceed the functional characteristics of plantorigin polysaccharides, in addition to following advantages: production independent on
weather conditions, possible use of regional materials, faster to obtain the finished
product and need relatively little space for its production. This study aimed to
characterize the strains IPA 403 and IPA 49 by analysis of 16S rDNA amplified region
by polymerase chain reaction (PCR). The CIAT 899 (CIAT - Colombia) was used as
standard to evaluate the production of biopolymers, rheology and chemical composition
of strains in times of 132, 144 and 168 hours of culture and identify soluble intracellular
proteins through techniques of 2D - PAGE and mass spectrometry in time of 168 hours
of culture.. The strains identification (IPA 403 and IPA 49) isolated from the Semiarid
Pernambuco – Araripe region were performed by comparing partial sequences of 16S
rDNA. The polymerase chain reaction was performed using the Y1 and Y3 reaction
indicator oligonucleotides designed to partial amplification of the 16S rRNA gene of
rhizobia. The PCR reaction was conducted in a thermocycler with the following
program: initial denaturation at 94 °C for 2 min; 29 cycles of denaturation (94 °C for 45
s), annealing (50 °C for 45 s) and extension (72 °C for 1 min) and a final extension at 72
°C for 2 min. The biopolymers recovery was accomplished by ethyl alcohol (PA)
precipitation at a 1:3 (v/v) and production was obtained by evaluating the mass of dry
product per volume of culture medium. The viscosity was determined in a viscometer
with shear rate ranging between 39.6 S-1 to 165 S-1 and 1.5 mPa.s viscosity. The
contents of pyruvic acid and acetyl were performed and chemical composition was
obtained by chromatography in comparative thin layer. Based on 99% similarity, the
analysis of partial sequences of 16S rDNA confirmed that the strains studied belong to
the species Rhizobium tropici. Regarding the biopolymer production, the IPA 403 strain
was superior compared with strains CIAT 899 and 49 IPA, 25.44 g/L, 17.15 g/L and
11.25 g/L, respectively at 168 hours of culture. Regarding the rheological behavior of
biopolymers produced, the IPA 403 strain had the highest viscosity (224 mPa.s.)
between the strains studied. Concerning the chemical composition of biopolymers, the
IPA 49 strain obtained the highest percentage of acetyl and pyruvic acid, 5.60% and
7.00% respectively. With respect to content of sugars present in biopolymers, all strains
showed the presence of galactose and glucose. The fucose was only identified in CIAT
899 and IPA 49 while uronic acid was detected only in IPA 403. The proteomic analysis
of metabolites produced by strains CIAT 899, IPA 403 and IPA 49 at 168 hours of
culture showed several proteins, among them, the elongation factor TU, chaperone,
GroEL / GroES, glycosyltransferase (putative glycosyltransferase) that have as one of
the functions to catalyze the polysaccharide production. The dinitrogenase and
nitrogenase iron proteins are involved in the process of reducing the atmospheric
nitrogen making part of the nitrogenase complex. The protein glyceraldeideo-3-
phosphate dehydrogenase from the energy complex is involved in glycolysis, as well as
two other proteins, electron transfer flavoprotein beta subunit and dehydrogenase. The
results allowed evaluating the quality of the biopolymer produced by strains used in the
experiment and its proteome at the end of 168 hours of culture.
Keywords: Rhizobium; exopolysaccharides; 16S rDNA; chemical composition;
proteome.
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Oliveira, José de Paula. Caracterização genética, produção de biopolímeros extracelulares e proteoma de bactérias diazotróficas. 2011. 68 f. Tese (Doutorado em 2011) - Universidade Estadual do Ceará, , 2011. Disponível em: Acesso em: 3 de maio de 2024
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