Produção de caprinos transgênicos para o fator estimulante de colônias de granulócitos humano (hG-CSF) e caracterização fenotípica da fêmea fundadora
Autor(es):
Moura, Raylene Ramos
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2011
Resumo:
Caprinos têm sido utilizados como modelo de animais transgênicos secretando várias proteínas recombinantes no leite, dentre as quais o Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos humano (hG-CSF). Assim, este trabalho teve por objetivos: (i) produzir caprinos transgênicos fundadores para o hG-CSF e propagar o rebanho transgênico; (ii) caracterizar a dinâmica de produção do hG-CSF durante a lactação induzida da fêmea transgênica (FT), verificar a potencial expressão ectópica e desordens gerais de saúde da FT; (iii) monitorar ciclos estrais da FT por progesteronemia e avaliar a atividade ovariana, além de realizar superovulação e recuperação embrionária utilizando dois métodos (laparotomia e transcervical) para posterior transferência para receptoras a fim de acelerar a obtenção de descendentes da fêmea fundadora transgênica. Dois caprinos fundadores para o hG-CSF foram produzidos por microinjeção pronuclear, um macho (10M) e uma fêmea (12F). Após a reprodução dos fundadores, nove crias transgênicas foram obtidas. A FT secretou hG-CSF no leite de 93,9 a 1.474,6 μg/mL durante a lactação induzida. A proteína recombinante induziu a diferenciação de células-tronco umbilicais humanas em granulócitos neutrófilos apresentando atividade biológica in vitro. Não foi detectado hG-CSF sérico fora do período de lactação indicando ausência de expressão ectópica. Durante o tratamento hormonal de indução da lactação, a FT apresentou um aumento da contagem de neutrófilos, linfócitos e monócitos quando comparado com a fêmea não transgênica (FNT). O perfil de bioquímica sérica indicou funções hepática e renal compatíveis com a espécie. O intervalo médio entre os estros foi de 20,7 ± 0,6 e 19,7 ± 0,6 (P > 0,05) dias para FT e FNT, respectivamente. As concentrações de progesterona e atividade ovariana apresentaram-se normais em ambas as fêmeas. O número de ovulações foi similar entre a FT e FNT (12,0 ± 1,4 vs. 18,0 ± 4,2 CL; P > 0,05). Da mesma forma, nenhuma diferença significativa (P > 0,05) foi observada entre o método de recuperação de embriões cirúrgico e transcervical na FT (69,2% vs. 72,7%) e FNT (100,0% vs. 86,7%). Dezesseis embriões da FT foram transferidos para receptoras e oito crias foram obtidas. Três crias transgênicas, dois machos e uma fêmea, foram identificadas obtendo-se uma taxa de transgênicos de 37,5%. Dessa maneira, a cabra transgênica fundadora se mostrou saudável durante e após o período experimental, fértil por ter sido capaz de transmitir o transgene à progênie, além de expressar hG-CSF em quantidade suficiente para um biorreator comercial. Palavras-chave: Caprino. Transgênese. hG-CSF. Lactação. Reprodução
Abstract:
Goats are used as model of transgenic animals secreting several recombinant proteins in their milk, including human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF). Thus, this study aimed: (i) to produce transgenic goats expressing hG-CSF to found and propagate a transgenic herd; (ii) to characterize the dynamic profile of hG-CSF production during artificial lactation in a transgenic female (TF) and to assess its potencial ectopic hG-CSF expression and general health disorders; (iii) to monitor estrous cycle parameters of TF and to perform superovulation and embryo recovery (surgical and transcervical) for further transfer to recipients to obtain offspring quickly. After pronuclear DNA microinjection, two founders were obtained (one male (10M) and one female (12F)). After the founders reproduced, a total of nine kids that carried the hG-CSF transgene were generated. The TF secreted 93.9 to 1,474.6 μg hG-CSF/mL milk during artificial lactation. In addition, the recombinant protein presented in vitro biological activity on differentiation of human umbilical stem cells to neutrophil granulocyte series. No constitutive recombinant protein was detectable in serum outside of the lactation period. During the treatment to induce lactation, transgenic female presented increased neutrophil, lymphocyte and monocyte counts when compared to non-transgenic female (NTF). Serum biochemistry profiles indicated normal liver and renal functions. The mean interval between estrus was 20.7 ± 0.6 and 19.7 ± 0.6 (P > 0.05) days for the TF and NTF, respectively. Progesterone concentrations and ovarian activity were normal in both goats.The number of ovulations was similar between TF and TNF (12.0 ± 1.4 vs. 18.0 ± 4.2 CL; P > 0.05). No significant differences in ovulation (P > 0.05) were observed between the surgical and transcervical methods for TF (69.2% vs. 72.7%) or NTF (100.0% vs. 86.7%). Sixteen embryos from the TF were transferred to the recipients, and eight kids were born. Among these kids, the transgene was identified in three (two males and one female), for a transgenesis rate of 37.5%. Thus, the transgenic goat remained clinically health throughout the experimental period and after, she proved fertile and capable of transmitting the hG-CSF transgene to progeny and express hG-CSF in quantities sufficient for a commercial bioreactor. Keywords: Goat. Transgenesis. hG-CSF. Lactation. Reproduction
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Moura, Raylene Ramos. Produção de caprinos transgênicos para o fator estimulante de colônias de granulócitos humano (hG-CSF) e caracterização fenotípica da fêmea fundadora. 2011. 167 f. Tese (Doutorado em 2011) - Universidade Estadual do Ceará, , 2011. Disponível em: Acesso em: 3 de maio de 2024
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