Expressão do RNAm do kit ligand (KL), proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15) e fator de crescimento epidermal (EGF) e efeito das respectivas proteínas sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos
Autor(es):
Celestino, Juliana Jales de Hollanda
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2010
Resumo:
Os objetivos deste estudo foram: 1) quantificar os níveis de RNAm para o kit ligand (KL),
proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15) e fator de crescimento epidermal (EGF) em
ovários caprinos através da técnica de RT-PCR em tempo real; 2) avaliar o efeito da adição de
diferentes concentrações destas substâncias sobre a sobrevivência, ativação e crescimento in
vitro de folículos pré-antrais caprinos cultivados in situ e 3) investigar os efeitos do EGF
sozinho ou associado ao hormônio folículo estimulante (FSH) sobre a sobrevivência,
formação de antro e crescimento de folículos secundários caprinos isolados, bem como sobre
os níveis de RNAm para o EGF e receptor de FSH (FSH-R). Para o cultivo in situ, fragmentos
de córtex ovariano foram cultivados in vitro por um ou sete dias em MEM+
adicionado de
diferentes concentrações (0, 1, 10, 50, 100 ou 200 ng/mL) de KL, BMP-15 e EGF. Antes e
após cultivo, os fragmentos foram fixados e analisados por histologia, microscopia eletrônica
de transmissão e/ou de fluorescência, e os folículos foram classificados em primordiais,
transição, primários e secundários, bem como em normais ou atrésicos. Além disso, os
diâmetros oocitário e folicular também foram avaliados. Com relação ao cultivo de folículos
isolados, folículos secundários foram microdissecados e cultivados por seis dias em α-MEM+
contendo ou não FSH (100 ng/mL) e suplementado ou não com EGF (10 ng/mL). Os
resultados mostraram que os níveis de RNAm para KL, BMP-15 e EGF aumentaram com o
desenvolvimento folicular, sendo significativamente superiores em folículos secundários.
Além disso, os complexos cumulus-oócito de pequenos e grandes folículos antrais
apresentaram maiores níveis de RNAm para BMP-15 e EGF do que as suas respectivas
células granulosa/teca, acontecendo o mesmo para o KL somente nos grandes folículos
antrais. Após sete dias de cultivo, 50 ng/mL de KL promoveu a manutenção da sobrevivência
folicular, o crescimento e a transição para folículos primários. A adição de 100 ng/mL de
BMP-15 ao meio manteve a viabilidade, promoveu a ativação e o crescimento in vitro, além
do aumento do percentual de folículos secundários. E ainda, a utilização de 1 ou 10 ng/mL de
EGF promoveu a sobrevivência e aumentou as taxas de folículos primários, mantendo a
integridade ultraestrutural folicular. Já após cultivo dos folículos isolados, observou-se que o
EGF sozinho ou associado ao FSH promoveu significativa formação de antro e crescimento
folicular. Além disso, FSH, EGF ou ambos reduziram os níveis de RNAm para EGF,
enquanto o EGF reduziu os níveis de RNAm para FSH-R. Concluindo, os resultados deste
estudo mostraram que os RNAm para KL, BMP-15 e EGF foram detectados em todas as
10
categorias foliculares e tipos celulares investigados. A utilização de KL (50 ng/mL), BMP-15
(100 ng/mL) e EGF (1 ou 10 ng/mL) promoveu a manutenção da sobrevivência folicular, a
ativação e o desenvolvimento dos folículos pré-antrais caprinos. Além disso, o EGF e o FSH
promoveram o crescimento de folículos secundários caprinos, reduziram os níveis de RNAm
para o EGF, e ainda, o EGF diminuiu os níveis de RNAm para FSH-R em folículos
secundários caprinos cultivados.
Palavras-chave: KL. BMP-15. EGF. Cultivo in vitro. Folículos pré-antrais caprinos.
Abstract:
The objectives of this study were: 1) to quantify the mRNA levels of kit ligand (KL), bone
morphogenetic protein 15 (BMP-15) and epidermal growth factor (EGF) in goat ovaries by
real-time RT-PCR; 2) to evaluate the effect of adding different concentrations of those
substances on the survival, activation and in vitro growth of caprine preantral follicles
cultured in situ and 3) to investigate the effects of EGF alone or in combination with follicle
stimulating hormone (FSH) on the survival, antrum formation and growth of isolated
secondary follicles from goats, as well as on the EGF and FSH receptor (FSH-R) mRNA
levels. To the in situ culture, fragments of ovarian cortex were cultured in vitro for one or
seven days in MEM+
supplemented with different concentrations (0, 1, 10, 50, 100 or 200
ng/mL) of KL, BMP-15 and EGF. Before and after culture, the fragments were fixed and
analysed by histology, transmission electron microscopy and/or fluorescence, and the follicles
were classified as primordial, intermediate, primary and secondary, as well as normal or
atretic. Moreover, the oocyte and follicle diameters were also evaluated. With regard to
isolated culture, secondary follicles were microdissected and cultured for six days in α-MEM+
with or without FSH (100 ng/mL) and supplemented or not with EGF (10 ng/mL). The results
showed that KL, BMP-15 and EGF mRNA levels increased with follicular development and
were significantly higher in secondary follicles. In addition, the cumulus-oocyte complexes
from small and large antral follicles showed higher BMP-15 and EGF mRNA levels than their
corresponding granulosa/theca cells, which also occurred for KL only in the large antral
follicles. After seven days of culture, 50 ng/mL KL promoted the maintenance of follicular
survival and growth, and the transition to primary follicles. The addition of 100 ng/mL BMP15 to the medium maintained the viability and promoted the activation and growth in vitro,
and also increased the percentage of secondary follicles. Moreover, the use of 1 or 10 ng/mL
EGF promoted the follicular survival and increased the rates of primary follicles, maintaining
the integrity of follicular ultrastructure. After culture of isolated follicles, it was observed that
EGF alone or in combination with FSH promoted a significant antrum formation and
follicular growth. Furthermore, FSH, EGF or both reduced the EGF mRNA levels, while EGF
reduced the FSH-R mRNA levels. In conclusion, our results showed that KL, BMP-15 and
EGF mRNA were detected in all categories and follicular cell types investigated. The use of
KL (50 ng/mL), BMP-15 (100 ng/mL) and EGF (1 or 10 ng/mL) promoted the maintenance
of survival, activation and development of caprine preantral follicles. Furthermore, EGF and
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FSH promoted the growth of caprine secondary follicles, reduced the EGF mRNA levels, and
yet, EGF decreased the FSH-R mRNA levels in cultured goat secondary follicles.
Keywords: KL. BMP-15. EGF. In vitro culture. Caprine preantral follicles.
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Celestino, Juliana Jales de Hollanda. Expressão do RNAm do kit ligand (KL), proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15) e fator de crescimento epidermal (EGF) e efeito das respectivas proteínas sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2010. 318 f. Tese (Doutorado em 2010) - Universidade Estadual do Ceará, , 2010. Disponível em: Acesso em: 19 de abril de 2024
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