Cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos utilizando angiotensina II (ANG II), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP)
Autor(es):
Bruno, Jamily Bezerra
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2010
Resumo:
Os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito de diferentes concentrações da
angiotensina II (ANG II), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e peptídeo
intestinal vasoativo (VIP) no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos e
verificar a localização do receptor 2 do VEGF (VEGFR-2) e a expressão dos receptores da
ANG II (AGTR1 e AGTR2) em ovários caprinos. Para investigar a localização do VEGFR-2
e expressão do AGTR1 e AGTR2 no ovário caprino, foram empregadas as técnicas de
imunohistoquímica e PCR em tempo real, respectivamente. Para avaliar a eficiência das
substâncias supracitadas sobre a sobrevivência e o crescimento folicular, fragmentos de córtex
ovariano foram cultivados in vitro por um ou sete dias em meio essencial mínimo
suplementado (MEM+
) adicionado de diferentes concentrações das referidas substâncias.
Antes e após o período de cultivo, os fragmentos de córtex ovariano foram fixados e
processados para histologia clássica. Os folículos foram classificados quanto ao grau de
desenvolvimento em primordiais ou em desenvolvimento, e quanto à sobrevivência em
normais ou degenerados. O diâmetro folicular foi avaliado antes e após o cultivo. As técnicas
de microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão (MET) foram
utilizadas para melhor avaliar a viabilidade e morfologia desses folículos, respectivamente.
Após definição das melhores concentrações de VIP, foi realizado um último experimento a
fim de quantificar a expressão dos RNAm para o VIP em ovários caprinos através da técnica
de PCR em tempo real, e avaliar a influência do VIP isoladamente ou em associação ao FSH
sobre a sobrevivência e o desenvolvimento de folículos secundários caprinos isolados, bem
como sobre a expressão do RNAm para o VIP e receptor de FSH (FSH-R) nesses folículos
cultivados por seis dias. Os resultados do cultivo in vitro mostraram que após sete dias, 10
ng/mL de ANG II promoveu a manutenção da viabilidade e ultraestrutura de folículos préantrais caprinos. Os RNAm para AGTR1 e AGTR2 foram detectados em todas categorias e
tipos foliculares estudados. No que se refere ao VEGF, as concentrações de 10 e 200 ng/mL
foram mais eficientes para promover o crescimento e manter a viabilidade, respectivamente.
Além disso, o receptor VEGFR-2 foi encontrado em oócitos de folículos em todos os estágios
de desenvolvimento e em células da granulosa de folículos em crescimento. O VIP foi mais
efetivo em promover o crescimento e manutenção da ultraestrutura folicular após sete dias de
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cultivo quando utilizado na concentração de 10 ng/mL. A presença de RNAm para o VIP foi
demonstrada em todas categorias foliculares em ovários de cabras, mostrando um aumento em
seus níveis durante a transição de folículo primordial para secundário. No entanto, a utilização
de VIP e/ou FSH não afetou o desenvolvimento de folículos secundários e não alterou os
níveis de RNAm para FSH-R embora tenha reduzido os níveis de RNAm para o VIP após
cultivo in vitro de folículos pré-antrais por seis dias. Diante disso, concluiu-se que ANG,
VEGF e VIP apresentam importantes funções no desenvolvimento in vitro de folículos préantrais caprinos.
Palavras-chave: ANG II. VIP. VEGF. Pré-antral. Cultivo in vitro.
Abstract:
The aims of this study were to evaluate the effect of different concentrations of angiotensin II
(ANG II), vascular endothelial growth factor (VEGF) and vasoactive intestinal peptide (VIP)
on the caprine preantral follicle development and to verify the localization of VEGF receptor
2 (VEGFR-2) and the expression of ANG II receptors (AGTR1 and AGTR2) in goat ovaries.
In order to investigate the localization of VEGFR-2 and the expression of AGTR1 and
AGTR2 in goat ovaries, it was used the immunohistochemistry and real-time PCR techniques,
respectively. To evaluate the effect of the substances mentioned above on the survival and
follicular growth, fragments of ovarian cortex were cultured in vitro for one or seven days in
minimal essential medium (MEM+
) supplemented with different concentrations of these
substances. Before and after the culture period, fragments of ovarian cortex were fixed and
processed for histology. Follicles were classified according to their development as primordial
or developing, and for survival in normal or degenerated. The follicular diameter was
measured before and after culture. The fluorescence microscopy and transmission electron
microscopy (TEM) techniques were used to better evaluate the viability and morphology of
these follicles, respectively. After defining the best concentrations of VIP, a last experiment
was conducted to quantify the expression of VIP mRNA in goat ovaries by real-time PCR,
and evaluate the influence of VIP alone or in combination with FSH on the survival and
development of isolated secondary follicles and on the expression of VIP and FSH receptor
(FSH-R) mRNA in these follicles cultured for six days. The results of in vitro culture showed
that after seven days, 10 ng/mL ANG II promoted the maintenance of viability and
ultrastructure of goat preantral follicles. The AGTR1 and AGTR2 mRNA were detected in all
categories and follicular types studied. With regard to VEGF, the concentrations of 10 and
200 ng/mL were more effective to promote follicular growth and to maintain the viability,
respectively. Furthermore, the VEGFR-2 receptor was found in oocytes of follicles at all
stages of development and in granulosa cells of growing follicles. VIP was more effective to
promote the growth and the maintenance of follicular ultrastructure after seven days of culture
when it was used at 10 ng/mL. The results of real-time PCR demonstrated the presence of VIP
mRNA in all follicular categories of goat ovaries, showing an increase in VIP mRNA levels
during the transition from primary to secondary follicle. However, the use of VIP and/or FSH
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did not affect the development of secondary follicles and did not alter the FSH-R mRNA
levels, although it reduced the VIP mRNA levels after in vitro culture of preantral follicles for
six days. According to the results, it was concluded that ANG, VEGF and VIP have important
roles in the in vitro development of caprine preantral follicles.
Keywords: ANG II. VIP. VEGF. Preantral. In vitro culture.
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Bruno, Jamily Bezerra. Cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos utilizando angiotensina II (ANG II), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP). 2010. 222 f. Tese (Doutorado em 2010) - Universidade Estadual do Ceará, , 2010. Disponível em: Acesso em: 19 de abril de 2024
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