Proteína recombinante do vírus da artrite encefalite caprina com potencial antigênico
Autor(es):
Dantas, Tânia Valeska Medeiros
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2009
Resumo:
Em primeiro lugar procede a um levantamento dos principais estudos sobre proteínas
recombinantes e experimentos de vacinas contra o CAEV e outros lentivírus.
Secundariamente visa a produzir uma proteína recombinante do vírus da artrite encefalite
caprina com potencial antigênico para ser utilizado como antígeno em testes diagnósticos
sorológicos em sistema de expressão bacteriana e em plasmídeo, No tocante ao primeiro
objetivo, foi realizada uma revisão de literatura das pesquisas nos últimos dez anos (1998-
2008) referente às vacinas contra lentivírus animal. No que concerne à produção da proteína
recombinante do CAEV, foi realizada uma análise do gene do CAEV para determinar qual a
região do gene gag codificava para a p28 do vírus. A região considerada foi dos nucleotídeos
971-1606 do CAEV Cork. Os oligos foram desenhados desde o inicio e final da sequência (20
e 21pb). Foi realizada a ligação do gene da p28 do gag em plasmídeo pUC19 e depois uma
subclonagem em pET32b. Realizaram-se o sequenciamento de ambas as construções e a
purificação por cromatografia de afinidade. Procedeu-se à PCR de colônia e à extração de
plasmídeos por lise alcalina. A melhor condição de expressão da proteína recombinante foi
testada a 37ºC e temperatura ambiente, utilizando como indutor o isopropil β-D-1-
thiogalactopiranosidase (IPTG) nas concentrações de 0,5, 1 e 3mM. Para verificar o resultado
da expressão, as proteínas foram analisadas pela eletroforese em gel de poliacrilamida. Para
avaliar o seu potencial antigênico, foi efetuado o western blot, utilizando como antígeno a
proteína recombinante, e como anticorpo primário o soro de animal soropositivo. O
sequenciamento confirmou a correta inserção do fragmento do gene da p28 nos dois
plasmídeos, os quais apresentaram uma banda de 636 pb após a PCR na eletroforese em gel
de agarose. A bactéria E. coli expressou a proteína em diversas condições. A 37ºC a bactéria
expressou a proteína em menores intensidades e na concentração a 0,5 mM de IPTG, não
houve expressão. A temperatura ambiente, em todas as concentrações, a proteína foi expressa,
sendo que a 1 mM de IPTG apresentou maior intensidade. Com base nos resultados,
considerou-se a melhor condição de expressão da proteína p28 recombinante em E.coli BL21
o tratamento de 1 mM de IPTG a temperatura ambiente. Ao analisar o potencial antigênico da
proteína recombinante no western blot, essa reagiu com o soro positivo, apresentando forte
banda característica de peso moleular 28 kDa. Conclui-se que houve a produção da proteína
p28 do CAEV recombinante pela bactéria e essa apresenta um potencial antigênico que
provavelmente poderá ser utilizado como antígeno em testes diagnósticos.
Palavras-chaves: Lentivírus. Expressão de p28. Clonagem. Western Blot. Antigenicidade.
Abstract:
he present study had two objectives, first to survey the main studies on recombinant proteins
and vaccine experiments against CAEV and other lentivirus and second, to produce a
recombinant protein from the Caprine Arthritis Encelhalitis virus with antigenic potential for
use as antigen in serological diagnoses in a bacterial and plasmid expression system.
Regarding the first objective the research of the last ten years (1998-2008) was revised in the
literature regarding vaccines against animal lentivirus. Regarding the production of CAEV
recombinant protein, the CAEV gene was analyzed to determine which region of the gag gene
codified for the virus p28. The region considered was of the 971-1606 nucleotide of the
CAEV Cork deposited in the gene bank. The primers were designed from the start of the
sequence (20bp) and the end of the sequence (21bp). The p 28 gene was linked to the gag in
pUC19 plasmid and then subcloned in pET32b. Both the constructions were sequenced and
purified by affinity chromatography. PCR was performed on the colony and the plasmids
extracted by alkaline lysis. The best expression condition of the recombinant protein was
tested at 37oC and room temperature, using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) as
inductor at the concentrations of 0.5, 1 and 3 mM. To verify the result of the expression, the
proteins were analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gel. Western blot was
performed to assess their antigenic potential using the recombinant protein as antigen and the
serum from a proven positive animal as primary antibody. Sequencing confirmed the correct
insertion of the p28 gene fragment in the two plasmids, which presented a band of 636 bp
after PCR in electrphorosis in agarose gel. The E. coli bacteria expressed the protein under
various conditions. At 37oC the bacteria expressed the protein at lower intensities and there
was no expression at the 0.5 mM IPTG concentration. The protein was expressed at room
temperature at all the concentrations and at 1 mM IPTG the protein presented greater
intensity. Based on the results the treatment of 1 mM IPTG and room temperature was
considered the best expression condition of the p28 recombinant protein in E. coli BL21.
When analysing the antigenic potential of the recombinant protein in western blot it reacted
with the positive goat serum and presented a strong band characteristic of 28 kDa molecular
weight. It was concluded that the CAEV p28 recombinant protein was produced by the
bacteria and it presented an antigenic potential that could probably be used as antigen in
diagnostic tests.
Key words: Lentivirus. p28 expression. Cloning. Western blot. Antigenicity
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Dantas, Tânia Valeska Medeiros. Proteína recombinante do vírus da artrite encefalite caprina com potencial antigênico. 2009. 120 f. Tese (Doutorado em 2009) - Universidade Estadual do Ceará, , 2009. Disponível em: Acesso em: 29 de abril de 2024
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