Espermadesinas caprinas (bodesinas): produção em sistema bacteriano
Autor(es):
Cajazeiras, João Batista
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2009
Resumo:
A baixa eficiência de purificação e da caracterização incompleta das espermadesinas (Bdhs) caprinas (Capra hircus) nos levou a estabelecer um sistema eficaz para produzir as recombinantes (Bdhs). O cDNA da Bdh-2 e Bdh-4 foi inserido para ser expresso em um procarioto com plasmídio pTrcHis TOPO. O sistema pTrcHis-Bdh foi construído para produzir a proteína fusionada com a His6-tag em células de Escherichia coli Top 10. Os clones recombinantes foram selecionados através de crescimento em meio contendo ampicilina, amplificação por PCR e sequencia de nucleotídeo. Os insertos de cDNA foram completamente identificados e a síntese da proteína recombinante foi monitorada através de SDS-PAGE seguido por immunobloting usando anticorpo monoclonal anti histidina. A expressão das ambas rBdhs foi observada utilizando concentrações de IPTG nas concentrações de 0,1 até 2,0 mM e após incubação de 2 até 6 horas. A maior produção das rBdhs ocorreu com 1,5 mM IPTG após 2 horas de indução e com 0,3 mM de IPTG após 4 horas de cultivo. Entre os tempos de indução investigado, 6 horas mostrou os menores níveis de produção para Bdh-2 e Bdh-4, onde não se observou diferenças entre as diferentes concentrações de IPTG testado. O peso molecular aparente para Bdh-2 foi de 15,85 KDa e para Bdh-4 foi de 18,17 KDa. Esse resultado está de acordo com os teóricos peso molecular de 15,5 KDa para Bdh-2 e 16,5 KDa para Bdh-4 a partir da sequencia nucleotídica. Antes deste estudo, a expressão da espermadesina recombinante em caprinos (Capra hircus) nunca tinha sido relatad. Assim, um sistema eficaz de expressão de rBdh em procariótico foi estabelecido a fim de proporcionar uma boa ferramenta para estudar a biofunção de espermadesinas caprinas. Palavras-chave: Caprino, espermadesina, proteína recombinante
Abstract:
The low purification efficiency and the incomplete characterization of buck spermadhesins (Bdhs) prompted us to establish an effective system to produce recombinant Bdhs (rBdhs). The Bdh-2 and Bdh-4 cDNA was inserted in a prokaryotic expression plasmid pTrcHis TOPO. The pTrcHis-Bdh system was constructed to produce a His6 fusion protein in E. coli Top10 cells. The recombinant clones were selected by growth in ampicillin-containing medium, PCR amplifications and nucleotide sequencing. The inserted cDNA was completely identified and the recombinant protein synthesis was monitored by SDS-PAGE followed by immunoblotting using monoclonal anti-His antibody. The expression of both insoluble rBdhs was achieved at 0.1 to 2.0 mM IPTG and after 2 to 6 h of induction. A greater production of both rBdhs occurred with 1.5 mM IPTG after 2 h of induction, and with 0.3 mM IPTG after 4 h of culture. Among the induction times investigated, 6 h showed the lowest levels of rBdh-2 and Bdh-4 production, where no difference was seen between the various concentrations of IPTG tested (P > 0.01). The apparent molecular weight of rBdh-2 was 15.85 ± 0.09 kDa and rBdh-4 was 18.17 ± 0.03 kDa calculated by image analysis of membranes. This result agrees with the theoretical molecular weight of 15.5 kDa for Bdh-2 and 16,5 KDa for Bdh-4 predicted from the nucleotide sequence. Prior to this study, expression of recombinant buck spermadhesin had never been reported. Thus, an effective prokaryotic rBdh expression system was established in order to provide a good tool for studying the biofunctions of buck spermadhesins. Keywords: Goat, spermadhesin, recombinant protein.
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Cajazeiras, João Batista. Espermadesinas caprinas (bodesinas): produção em sistema bacteriano. 2009. 95 f. Tese (Doutorado em 2009) - Universidade Estadual do Ceará, , 2009. Disponível em: Acesso em: 6 de maio de 2024
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