Caracterizacao de B-Galactosidases Purificadas de Caules de Plantulas de Vigna...
Autor(es):
Suderio, Fabricio Bonfim
Palavras Chaves:
Não informado
Ano de Publicação:
2007
Resumo:
As B-galactosidades constituem uma ampla familia de enzimas envolvidas em varios processos biologicos em plantas, dentre eles o crescimento vegetal. Essas enzimas atuam como lactases, hidrolizando a lactose em galactose e glucose, e como transglicosilase, modificando a estrutura da lactose. Alem disso, essas enzimas catalisam a hidrolise enzimatica dos carboidratos e atuam sobre os componentes da parede celular durante o processo de expansao da parede. O estudo de purificacao e caracterizacao e de fundamental importancia para o esclarecimento do papel filosofico de uma enzima. No presente trabalho, isoformas da enzima B-galactosidase, denominadas B-gal I, B-gal II e B-gal III, foram isoladas de caules de plantulas de feijao-de-corda [Vigna unguiculata (L.)walp] cv Pitiuba semeadas em agua destilada (condiçoes controle) e em soluçao de NaCL 100 mM (tratamento salino), nos estadios de desenvolvimento III (ED III) - plantulas com radicula maior que 2 cm e menor que 5 cm - e VIII (ED VII) - plantulas com radicula maior que 5 cm, cotiledones fora do papel, hipocotilo reto e folhas cotiledonarias abertas O processo de purificaçao constitui de fracionamento com sulfato de amonio, seguido de cromatografia de troca ionica, em coluna de DEAE-Sephadex e em cromatografia em coluna de afinidade Lactosil-Sepharose. As duas isoformas citosolicas (B-gal I e B-gal II) mostraram os mesmos padroes cromatograficos, os quais diferiram, os quais diferiram do padra da B-gal III, presente na parede celular. A eletroforese em condiçao nativa e em pH acido revelou que a B-gal II e a B-gal III apresentaram uma unica banda no coramento para proteina e uma unica banda com atividade B-galactosidasica. As B-gal I,II e III apresentaram massas moleculares aparentes de 89, 146 e 124 kDa, respectivamente, em todas as condiçoes estudadas. As tres isoformas mostraram o mesmo pH otimo (4,0) e mesma temperatura otima de ensaio (55ºC) para a atividade enzimatica. Em relaçao a estabilidade termica, as B-gal I, II e III mostraram-se estaveis ate a temperatura de 50ºC, havendo um decrescimo na sua atividade a 60ºC e perdendo totalmente a atividade em 70ºC. AS curvas de termoinativaçao em funçao do tempo para as B-gal I,II e III mostraram que, na temperatura de 60ºC, as curvas foram bifasicas, com uma fase inicial rapida, com grande perda da atividade, e uma segunda, mais lenta, com perda de atividade gradual ate 80 minutos de incumbaçao. Nos estagios de desenvolvimento (III e VIII) e nos tratamentos controle e salino, tanto a glugose quanto a galactose protegeram as enzimas contra a inativaçao termica, sendo que a perda de atividade das enzimas foi menor na presença de glucose. De todos os açucares testados quanto aos seus efeitos nas atividades das B-gal I, II e III, na presença do B-PNPG, a galactose foi a que mais inibiu a atividade das enzimas. Os valores de Kme de Vmax foram, respectivamente, de 1,69 e 0,29, para B-gal I, de 1,92 e 0,99, para B-gal II, e 1,01 e 0,41, para B-gal III. A B-gal I e a B-gal II foram inibidas competitivamente pela galactose, com coeficientes de inibiçao (Ki) iguias a 28,0 e 7,6 mM, respectivamente, enquanto a B-gal III apresentou um padrao de inibiçao mista. A B-gal I apresentou atividade com todos os substratos sinteticos testados. A B-gal II apresentou apenas atividades B-fucosidasica e arabinosidasica. A B-gal III apresentou atividades galactosidasica, B-fucosidasica e arabinosidasica, mas praticamente nao teve atividade B-xilosidasica e nao apresentou atividades manosidasica e fucosidasica. Os resultados de RT-PCR a aprtir de RNA total de caules de plantulas de feijao-de-corda semeados em condiçoes controle e de tratamento salino, nos estadios de desenvolvimento III e VIII revelaram a amplificaçao de um fragmento de cDNA de tamanho molecular esperado em torno de 1.900 pb em todas as condiçoes testadas e que o maior nivel de transcrito foi detectado no estadio de desenvolvimento VIII (controle). No estadio VIII do tratamento salino, o nivel de transcritos foi inferior ao das condiçoes controle do mesmo estadio e as quantidades de transcritos detectados no estadio de desenvolvimento III, tanto em condiçoes controle como de tratamento salino, foram bem mais baixas. Esses resultados mostram que as B-gal I,II e III, nao sofrem modificaçoes ao longo dos estadios iniciais de desenvolvimento, que ha diferenças entre as propriedades das tres isoformas, que a salinidade pode efetar a expressao genica das enzimas e que as enzimas sao expressas diferentemente nos estadios de desenvolvimento III e VIII.
Abstract:
Não informado
Tipo do Trabalho:
TCC
Referência:
Suderio, Fabricio Bonfim. Caracterizacao de B-Galactosidases Purificadas de Caules de Plantulas de Vigna.... 2007. Sem Numeração Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em 2007) – Universidade Estadual do Ceará, , 2007. Disponível em: Acesso em: 26 de abril de 2024
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