Bioprodutos formulados com plasma rico em plaquetas e/ou fatores de células-tronco para o mercado veterinário
Autor(es):
Freitas, Natália Pereira Paiva
Palavras Chaves:
equino; canino; terapia regenerativa
Ano de Publicação:
2022
Resumo:
Os avanços na área da medicina regenerativa veterinária têm crescido nos últimos anos no sentido de intensificar o uso do plasma rico em plaquetas (PRP) e células-tronco mesenquimais (CTMs), pois são ricos em fatores de crescimento com ação na regeneração de tecidos. Apesar de serem frequentemente utilizados na medicina veterinária, PRP e CTMs apresentam importantes limitações relacionadas à sua perecibilidade, o que dificulta o armazenamento e transporte, e à falta de controle de qualidade no processo de produção. O presente estudo visou estudar inovações que possam superar as limitações atuais, com destaque para a incorporação do processo de liofilização para superar à questão da perecibilidade e o uso de meio de cultivo celular contendo fatores de crescimento em substituição a CTMs através da realização de testes in vitro e in vivo com o uso de PRP e de meio condicionado de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (MC-AdCTMs), ambos liofilizados, para as espécies canina e equina. Foram utilizados sangue total e CTMs provenientes de tecido adiposo para produção do PRP e MC-AdCTMs, respectivamente. Em uma primeira fase, compondo o CAPÍTULO 1 dessa tese, foram realizadas análises para validação in vitro da produção de PRP canino liofilizado. Nesse caso, foi avaliado a concentração dos fatores de crescimento VEGF e TGF-β antes e após o processo de liofilização, a estrutura tridimensional sob microscopia eletrônica do PRP liofilizado reconstituído em forma de gel e seu efeito na proliferação in vitro de CTMs. Complementarmente, foi realizado um teste de imunogenicidade a partir de amostras alogênicas de PRP canino liofilizado. Em uma segunda etapa, compondo o CAPÍTULO 2, foi realizada a validação da produção e uso de PRP e MC-AdCTMs liofilizados para a espécie equina. Nos testes in vitro foram avaliadas as concentrações dos fatores de crescimento PDGF e VEGF, por meio de ensaio de ELISA, em amostras frescas e liofilizadas de PRP e MC-AdCTMs. Um teste de estabilidade das amostras liofilizadas foi realizado com análise da quantificação de PDGF e VEGF após 90 e 180 dias de armazenamento. Adicionalmente, para avaliação do potencial terapêutico, foram realizadas aplicações in vivo de PRP, MC-AdCTMs ou de sua associação, todos reconstituídos após liofilização, em feridas cutâneas induzidas em equinos. A evolução do processo regenerativo das lesões foi acompanhada por meio de mensurações da área das feridas, do processo inflamatório e necrótico, além de análise histopatológica. Os resultados gerados a partir dos experimentos que compõem os CAPÍTULOS 1 e 2 evidenciaram que, primeiramente, o PRP canino liofilizado (VEGF 9.10 pg/mL e TGF- β 8228.57) manteve uma alta concentração de fatores de crescimento em relação ao PRP fresco (VEGF 5.55 pg/mL e TGF- β 3171.70), mostrou-se biocompatível e não imunogênico. Na espécie equina, a quantificação de fatores de crescimento a partir de amostras frescas e liofilizadas de PRP e MC-AdCTMs não diferiu ao longo de um período de armazenamento de 90 dias. No teste de regeneração in vivo, não houve diferença no tempo de cicatrização, assim como, nas análises histopatológicas entre os grupos. Foi observada uma diferença apenas de tempo, entre a primeira e segunda biópsia, para as variáveis inflamação, fibroplasia e colágeno. Os resultados obtidos posicionam o uso de PRP e MC-AdCTMs liofilizados como alternativas potencialmente viáveis para a geração de bioprodutos com maior capacidade de armazenamento e aumento da vida de prateleira. No entanto, mais estudos são necessários para determinar a eficácia in vivo da utilização de PRP e MC-AdCTMs liofilizados.
Abstract:
Advances in the field of veterinary regenerative medicine have grown in recent years to intensify the use of platelet-rich plasma (PRP) and mesenchymal stem cells (MSCs), as they are rich in growth factors with action in tissue regeneration. Despite being frequently used in veterinary medicine, PRP and MSCs have important limitations related to their perishability, which makes storage and transport difficult, and the lack of quality control in the production process. The present study aimed to study innovations that can overcome current limitations, with emphasis on the incorporation of the freeze-drying process to overcome the issue of perishability and the use of cell culture medium containing growth factors instead of MSCs through in vitro and in vivo tests with the use of PRP and adipose stem cell-culture medium (ASC-CM), both freeze-dried, for canine and equine species. Whole blood and MSCs from adipose tissue were used to produce PRP and ASC-CM, respectively. In a first phase, composing CHAPTER 1 of this thesis, analyzes were carried out for in vitro validation of the production of freeze-dried canine PRP. In this case, the concentration of VEGF and TGF-β growth factors before and after the freeze-drying process, the three-dimensional structure under electron microscopy of the freeze-dried PRP reconstituted in gel form and its effect on the in vitro proliferation of MSCs were evaluated. In addition, an immunogenicity test was performed using allogeneic samples of freeze-dried canine PRP. In a second step, composing CHAPTER 2, the validation of the production and use of freeze-dried PRP and ASC-CM for the equine species was carried out. In the in vitro tests, the concentrations of the growth factors PDGF and VEGF were evaluated, by means of an ELISA, in fresh and freeze-dried samples of PRP and ASC-CM. A stability test of the freeze-dried samples was performed with analysis of the quantification of PDGF and VEGF after 90 and 180 days of storage. Additionally, to assess the therapeutic potential, in vivo applications of PRP, ASC-CM or their association, all reconstituted after freeze-drying, were performed in induced skin wounds in horses. The evolution of the regenerative process of the lesions was monitored by means of measurements of the wound area, the inflammatory and necrotic process, in addition to histopathological analysis. The results generated from the experiments that make up CHAPTERS 1 and 2 showed that, first, freeze-dried canine PRP (VEGF 9.10 pg/mL and TGF-β 8228.57) maintained a high concentration of growth factors in relation to fresh PRP (VEGF 5.55 pg/mL and TGF-β 3171.70), was shown to be biocompatible and non-immunogenic. In the equine species, the quantification of growth factors from fresh and freeze-dried samples of PRP and ASC-CM did not differ over a storage period of 90 days. In the in vivo regeneration test, there was no difference in healing time, as well as in the histopathological analyzes between the groups. There was only a difference in time between the first and second biopsy for the variables inflammation, fibroplasia and collagen. The results obtained position the use of freeze-dried PRP and ASC-CM as potentially viable alternatives for the generation of bioproducts with greater storage capacity and increased shelf life. However, further studies are needed to determine the in vivo efficacy of using freeze-dried PRP and ASC-CM.
Tipo do Trabalho:
Tese
Referência:
Freitas, Natália Pereira Paiva. Bioprodutos formulados com plasma rico em plaquetas e/ou fatores de células-tronco para o mercado veterinário. 2022. 103 f. Tese (Doutorado em 2022) - Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, 2022. Disponível em: Acesso em: 17 de março de 2025
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